Géntechnológia

Másnéven génsebészet, „genetic engineering”

Lehetővé teszi:
- Az élőlények egyes tulajdonságait meghatározó
gének azonosítását, jellemzését és szabadon
történő megváltoztatását,
így téve lehetővé a az egyes gének és az általuk kódolt
fehérjék működésének megismerését
- Az egyes élőlények teljes genetikai állományának
megismerését (DNS szekvenálás)
- Irányított mutációkat hozhatunk létre,
eltávolíthatunk egyes géneket de újakat is adhatunk a
genetikai állományhoz
- Saját sejtjeinkbe új genetikai információt bejuttatni
bizonyos betegségek gyógyítása érdekében
(génterápia) 2
- Géneket „átültethetünk” más organizmusokba
(kód univerzális), ez használható fehérjék
termelésére (fehérje expresszió)

- Az eredetitől eltérő funkciót vagy aktivitást is

„hozzárendelhetünk” egy fehérjéhez
(fehérjemérnökség, „protein engineering”)
 A. Rekombináns DNS technológia
Ahhoz hogy ezeket a technikákat gyakorlatban
alkalmazni lehessen, rekombináns DNS-re van szükség
A rekombináns DNS egy hordozó DNS molekulából
(vektor) és a vizsgálni kívánt DNS-ből (inzert) álló „hibrid”
(kiméra) molekula, melyeket molekuláris klónozással
állítunk elő
Rekombináns DNS = vektor DNS + inzert DNS

4
 1.Molekuláris klónozás
Egy specifikus inzertet tartalmazó rekombináns DNS
felszaporítása megfelelő gazdasejtben (pl. E. coli).

Ezeknek a sejteknek a klónjaiból (bakteriális kolóniák)

izolálhatjuk a molekuláris klón rekombináns DNS-t
 2. Inzertek
Típusai:

– Gén: egy fehérje teljes génje (ezt használjuk, ha

a gént akarjuk vizsgálni)

– Génfragmens

– cDNS (complementary - komplementer DNS): az

mRNS-ről reverz transzkriptáz enzimmel
készített másolat (ezt használjuk ha fehérjét
akarunk expresszálni)
6
 a. Inzertekhez való hozzájutás
- Előállíthatjuk az inzertet mi magunk, ha
rendelkezünk a genomiális DNS-mintával
(a genomiális DNS-ből a minket érintő szakaszt PCR-rel
tudjuk felsoszorozni)
- Szintetizáltathatjuk az inzertet bázisokból (drága, de
gyors)
- - Klónadatbázisból (pl. Addgene) megvesszük az
inzertet tartalmazó rekombináns DNS-t, amiből
restrikciós enzimekkel kivághatjuk a szakaszt, és
PCR-rel felszaporíthatjuk („subcloning”) (ez a
legolcsóbb)
7
 3. Vektorok
• A klónozandó DNS (az inzert) hordozómolekulái
• Legfőbb tulajdonsága, hogy képes önálló
szaporodásra valamilyen gazdaszervezetben
• Kis méretűnek kell lennie (2-200 kbp)
• Egyedi restrikciós helyekkel (ahol a DNS-t el lehet
vágni) kell rendelkeznie
• Tartalmaznia kell legalább egy szelekciós marker
gént (ami előnyt biztosít a vektort tartalmazó
organizmusnak)
• Vektorok eredetük szerint lehetnek: plazmidok,
fágok, kozmidok, vírusok 9
 A. Vektorok felépítése
• Szelekciós marker:
a táptalajon kizárólag a vektort tartalmazó
baktériumok növekedését teszi lehetővé (általában ez
antibiotikum-rezisztencia gén)
• Klónozó hely:
a vektorban az inzert előtti és utáni, csak egyszer
előforduló jellegzetes, rövid (néhány bázispár) szekvencia,
mely lehetővé teszi az inzert kihasítását/beépítését
• Promóter régió:
közvetlenül a klónozó hely és a gén előtt helyezkedik el,
lehetővé teszi a transzkripciót (az RNS átírását),
meghatározza a fehérje mennyiségét.
Általában szabályozható
10
 B. Vektorok típusai
a. Klónozó vektorok
• Amibe egyszerűen lehet DNS szakaszt inzertálni
• DNS információ tárolására, sokszorosítására
használjuk
• Multiklónozó hellyel (MCS: multiple cloning site)
kell rendelkezzen: a vektorban csak egyszer
előforduló báziskobináció, az inzert két oldalán.
Ezt ismeri fel a DNS polimeráz a klónozásnál.

11
 b. Expressziós vektorok
• Olyan vektorok, amelyek az inzertről való
fehérje átírást segítik első sorban (a fehérje
expressziót)
• Tartalmaznia kell egy szabályozható promóter
régiót (olyan bázisok, amelyek nem kódolnak
fehérjét, hanem az RNS átírás kezdőpontjai)
 C. Antibiotikum-rezisztencia
• Az antibiotikum átalakítását és közömbösítését
végző enzim génje a vektorba építve szelekciós
markerként használható
• Adott antibiotikumot tartalmazó táptalajon csak
azok az egyedek lesznek életképesek, amelyekbe
bekerült a vektor DNS
• Leggyakoribb: ampicillin, kanamicin sztreptomicin

ampicillin kanamicin sztreptomicin

 D. Plazmid, mint vektor DNS
• Gyűrű alakú, kettős szálú DNS-t tartalmaz
• Főleg baktériumokban található
• Az örökítő információk sejtek közötti átadását teszik
lehetővé kromoszómáktól függetlenül
• Extrakromoszomálisan, a citoplazmában helyezkedik el
• A kromoszómáktól és sejtosztódástól függetlenül
replikálódhatnak (másolódhatnak) és egyik sejtből a
másikba átadódhatnak
• Molekuláris biológiai felhasználásuk: klónozó és
expressziós vektorok

14
Annak eldöntésére, hogy egy plazmid tartalmazza e
az inzertet:
„Kék-fehér” szelekció
• Azok a baktériumtelepek, amelyekben a sikeresen
klónozott, inzertet tartalmazó plazmid van,
fehérek lesznek, az üres vektor tartalmazó telepek
viszont kékek
 Beépíthető még egy szelekciós marker

Pl. T7 lac
vektor

MCS

inzert

MCS

Szelekciós marker lehet

Itt kezdődik a replikáció

17
 4. Gazdaszervezetek
• A legelterjedtebb gazdaszervezet: Escherichia coli
(molekuláris klónozás mindig itt történik), annak a
nem-patogén K-12-es törzse (az emberi
bélcsatornában nem képesek szaporodni), illetve
fehérje expresszióhoz a BL21-es törzs

18
• Eukarióta gazdaszervezetek
(élesztő, rovar, növényi, állati, emberi sejtek):
csak ún. „shuttle” vektorokat használhatunk, amik
képesek kétféle gazdaszervezetben is szaporodni
(oka: a molekuláris klónozás, felszaporítás minden
esetben E. coliban történik, és a már felszaporított
konstrukciót juttatjuk be az eukarióta gazdába)
 Emlős expressziós vektorok
– Legtöbb eleme különböző emlős sejteket fertőző
vírus genomjából származik
– Leggyakoribb: bakteriális eredetű plazmid, vírus
elemekkel keverve, erős promóterrel.
Bakteriális és emlős sejttípusokban is működnek
- Használhatunk rekombináns vírusokat is
vektorként (papillomavírus, retrovírusok, stb.), a
fehérje expresszió ezzel általában nagyobb, mint
plazmidokkal
20
21
 5. Molekuláris klónozás menete
Molecular cloning
I. A plazmid vektorba építjük az inzertet (in vitro
rekombináció), és bejuttatjuk, majd felszaporítjuk
megfelelő gazdaszervezetben
• Szükséges hozzá:
–DNS molekulát „szabni-varrni” tudó enzimek
(restrikciós endonukleázok, DNS-ligázok)
–Vektor (általában plazmid) és inzert DNS (általában
eukarióta)
–Gazdasejt, és a bejuttatáshoz szükséges anyagok
22
 A molekuláris klónozás enzimei
a. Restrikciós endonukleázok
–Foszfodiészter kötést hidrolizáló enzimek
–A baktériumokat az idegen DNS-el szemben is védő
molekuláris rendszer
–Nagy számban fordulnak elő (~4000), nagy
géntechnológiai változatosságot biztosítva
–Szekvenciákat ismernek fel, specifikus helyeken
(ált. 4-8 bp)
–Hasítás történhet tompa végek (blunt end) és
ragadós végek (sticky end) keletkezésével is
–Pl. EcoRI, NheI, Xhol, DraI, HindIII, stb.
23
Ragadós végek keletkezése

Tompa végek keletkezése

b. DNS-ligáz
– Foszfodiészter-kötés létrehozásával képes két
DNS molekulát vagy egy DNS molekula két
végét kovalensen öszekapcsolni
– Leggyakrabban a T4 vírussal fertőzött E. coli-ból
izolált T4- ligázt használják
Inzert beillesztése
Rekombináns DNS létrehozása direkcionális klónozással

27
 II. Génbeviteli eljárások
Többféle módszerrel lehet az elkészült rekombináns
plazmidot a sejtbe bevinni
a. Transzformálás:
A baktériumsejtek képesek a környezetből DNS
molekulák (pl. plazmid DNS) felvételére, ez az eljárás
a transzformáció
Kompetens sejtekre van hozzá szükség (kompetens
az a sejt, mely képes a környezetéből DNS-t felvenni)
Legkönnyebben az E. coli tehető kompetenssé
(pl. CaCl2- oldatban való inkubációval, mely segíti a
plazmid DNS kötődését a baktériumfalhoz;
vagy hősokkal, melytől a sejtmembrán fluidabb
lesz) 28
b. Transzfekció:
• Alapja ugyanaz mint a transzformálásé, csak itt a
célsejtek eukarióta sejtek
• Kémiai transzfekció: kationos hordozóhoz kötik a negatí
töltésű DNS-t és ezt a komplexet juttatják be a sejtbe
• Kationos lipid (pl. lipofektamin): micellákat képez,
magába foglalva a DNS-t
• Kalcium-foszfát: foszfát pufferhez (pl. HEPES) CaCl2-t
adunk, a keletkező Ca3(PO4)2 csapadék a felületén
megköti a DNS-t

29
c. Infekció:
•Rekombináns fág (baktériumvírus)
(baktériumokba) vagy vírus (emlős sejtekbe)
segítségével juttatjuk be a rekombináns DNS-t
•Előnye: gyakorlatilag 100% hatékonyságú
d. Elektroporáció:
•Az egyik leghatékonyabb módszer minden sejttípusra
•A sejtszuszpenziót és a bejuttatni kívánt plazmidot
olyan küvettába helyezzük, aminek két oldalán
aluminium-elektródák találhatók és nagyfeszültséget
hozunk létre (10,000-100,000 V/cm3 néhány µs-ms-
ig)
•Ez ideiglenesen lyukakat képez a foszfolipid kettős
rétegben és a sejtfalon, amin keresztül megindul a
plazmid beáramlása. 31
•Amint a membrán töltöttsége megszűnik, a lyukak
bezáródnak és a sejteket gyorsan táptalajba
helyezzük regenerálódásra

•Hátránya: igen toxikus;

•Előnye: nagy hatásfokú
 6. Emlős sejtvonalak

• A fehérje expresszióra használt sejtvonalakat primer

sejttenyészetekből nyerik, de immortalizáltak.
• Ez azt jelenti, hogy korlátlan ideig képesek
sejtosztódásra, kultúráik hosszú ideig fenntarthatók
• immortalizálás vírusokkal; vagy daganatos sejt ami
természetes módon „halhatatlan”
• Leggyakoribb sejtvonalak:
– CHO: Chinese hamster ovary – kínai hörcsög petefészek
– COS: afrikai zöld majom veséjéből, SV40 vírussal
immortalizálva
– HeLa: Henrietta Lacks méhnyakrákos sejtjeiből
származik, természetes módon halhatatlan
– HEK293: human embriotic kidney, emberi embrió
vese sejt, adenovírussal immortalizálva
HEK293 HeLa CHO

34
 1. Stabil transzfekció
• Az expressziós vektor beépül a gazdasejt genomjába
(integrálódó vektor)
• Hatásfoka nagyon kicsi, mindenképp szükség van
szelekciós markerek használatára
• A stabilan transzfektált sejtek már külön sejtvonalat
alkotnak és önállóan fenntarthatók
• Előny:
- homogenitás (a sejtek 100%-a a kívánt fehérjét
gyártja)
- stabilitás
-kevésbé „szól” bele a sejt normál működésébe
2. Tranziens transzfekció
Az expressziós vektor nem integrálódik a genomba,
csak a transzfektált sejtekben fejeződik ki a fehérje,
nem képes stabil klónok létrehozására
• Előnye: magas fehérje expressziós szint, nincs
szükség szelekcióra, a transzfekció után a
sejtek 12- 72 órával már vizsgálhatók
• Hátránya: nem hat a teljes sejthalmazra,
hatásfoka kicsi

32
Transzfekció sikerességének ellenőrzése: fluoreszcens
fúziós fehérjékkel
7. Gén bejuttatása növényi sejtekbe
Génpuska – particle gun

A DNS–t mikrolövedékeket (wolfram vagy arany

részecskék) felületére rögzítik
50 bar nyomásértékű N2 gáz és – 0,7 bar vákuum
egyidejű alkalmazása mellett nagy sebességre
gyorsítják fel, így a részecskék áthatolnak a sejtfalon
és a sejtmembránon
A sejtek egy része túléli az így okozott sérülést,
genomjába a belőtt DNS–t is beépítheti
 B. Génterápia
Szemben a korábbi eljárásokkal, elsődleges célja
tehát nem máshonnan származó gének sejtbe
juttatása hanem a géneken belüli hibák kijavítása
vagy hibásan működő gének kiütése a szekvencia
megváltoztatásával
1. Génszerkesztés
Az eljárás során a DNS vágásával módosíthatják a
gének működését, kikapcsolnak géneket vagy
kijavítanak hibás DNS-szakaszokat.
A kivitelezés úgy történik, hogy egy adott ponton
elvágják a DNS-szálat, majd módosítják a szükséges
helyen.
A leggyakrabban használt génszerkesztő „eszköz” a
CRISPR-Cas rendszer
(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats -
halmozottan előforduló, szabályos közökkel elválasztott palindromikus
ismétlődések)
A CRISPR-rendszer a baktériumok védekezési módszere a
vírusok ellen.
Amikor egy bakteriofág megfertőz egy baktériumot,
akkor a sejt a vírus DNS egy kis részét beépíti a saját DNS-
ébe.
Azt szakaszt a DNS-ben, ahová a baktériumsejt az idegen
virális DNS-t elraktározta, CRISPR szakasznak nevezzük.
A sejtben lévő Cas9 enzim a beépült vírus DNS alapján a
baktériumsejtbe újra behatoló vírus DNS-t felismeri, majd
elvágja, feldarabolja
2. Génterápiás lehetőségek
- A mutáns gén helyettesítése génbevitellel, pl. vírusok
segítségével.
- Hibás gének módosítása CRISPR technikával, hibás gén
kiütése, csendesítése.
Fő felhasználás a rákkutatásban, ill. a daganatos betegségek
terápiájában is.
A tumorsejtek számos génmutációt hordoznak, amelyek
hozzájárulnak a tumorok kialakulásához és továbbfejlődéséhez.
A mutációk hatására onkogének bekapcsolódhatnak,
tumorszupresszor gének kieshetnek,
miáltal a sejtek osztódása gyorsul, alkalmatlanná válhatnak a
programozott sejthalálra és kontrollálatlanul osztódó,
halhatatlan tumorsejtekké alakulhatnak.
A géndiagnosztikai eljárásokkal azonosíthatók a
rosszindulatú daganatok kialakulásáért felelős
gének,
mint pl. a BRCA-1 és BRCA-2 gének, melyek
mutációja a mell-, illetve a petefészekrák
kialakulásában jelentős.
A CRISPR módszerrel egyrészt
tumorszupresszor gének aktíválhatók,
másrészt onkogének kikapcsolhatók a bevitt
pontmutációk kiváltásával.
A CRISPR genomszerkesztő módszer
felhasználható a tumorok immunterápiájában is
A CRISPR módszerrel módosított T-sejteket adnak
daganatos betegeknek.
A betegek véréből T-sejteket izolálnak, majd kiütik a
programozott sejthalált okozó fehérjét (PD-1-et), így
fokozva a T-sejtek aktivitását.
A módosított T-sejteket beadják a betegeknek, hogy
felszámolják a ráksejteket.
Másfelől a CRISPR módszerrel létrehozhatók olyan T-
sejtek, amelyek nem tartalmazzák a HIV vírus receptorait.
E gén kiütése a T-sejteken megakadályozza, hogy a sejt
megfertőződjön a HIV-vírussal, így nem fog elpusztulni, a
vírus meg nem tud szaporodni.
A génterápia egyéb alkalmazási területei
Általában olyan örökletes betegségek
gyógyításában eredményesek a génterápiás
módszerek, melyek kialakulását egyetlen gén
hibájára lehet visszavezetni,
ilyenek pl.
- a cisztás fibrózis,
- a vérzékenység,
- fenilketonúria
3. Génterápia módjai
a. Szomatikus génterápia
- a meglévő betegségek vagy betegségre
hajlamosító hibás gén kijavítását célozza meg
a születés után.
- A változás nem öröklődik
b. Csíravonal génterápia
- az ivarsejtek, illetve a zigóta, az embrió
genetikai állományának módosítása
- tovább öröklődik az utódokba
Ezen utóbbi módszer azonban igen komoly etikai problémákat vet
fel, mivel ez a változás tovább öröklődik, gyakorlatilag korlátlan
számú generáción át érvényesül, így napjainkban
- alkalmazása nem megengedett.
A génterápia alkalmazásának bioetikai problémái
A CRISPR/Cas9 rendszer alkalmas arra, hogy méhen
kívüli mesterséges megtermékenyítési eljárás során a
megtermékenyített emberi petesejtben vagy embrióban
olyan genetikai módosításokat hajtsanak végre, ami a
felnőtt ember minden sejtjében is jelen lesz.
Bizonyos tulajdonságok, mutációk, betegségre
hajlamosító tényezők így kiiktathatóvá válnak még az
embrió anyaméhbe ültetése előtt.
Ugyanakkor a csírasejtes génterápia számos
problémát vet fel, ezért a mai jogszabályok szerint az
emberi génterápia nem érintheti az ivarsejteket, illetve
a transzgén generációról generációra nem öröklődhet.
Magyarországi jogszabály szerint:

„Az olyan beavatkozás, amelynek tárgya

az emberi génállomány megváltoztatása,
csak megelőzési vagy gyógyítási indokból
hajtható végre, és csak akkor, ha nem célja
a leszármazottak genetikai állományának
megváltoztatása.”

Ezzel kizár minden olyan beavatkozást,

amelyek eredménye a következő
generációban is örökíthető lenne.
4. Etikai szempontok
- Joga van minden embernek világra jönni úgy, hogy saját,
mesterségesen meg nem változtatott genetikai
állománnyal rendelkezzen születésekor.
- tudományos ismereteink jelenleg nem elegendőek
ahhoz, hogy előre lehessen jelezni a csírasejtes
beavatkozások következményeit. 
- Az emberiség genetikai állománya az összes ember
közös tulajdona, s mint ilyet, néhány embernek nem
szabad mesterséges s önkényes módon
megváltoztatnia.
- Az emberiségnek nem szabad az evolúció természetes
folyamataiba beavatkoznia.
- Ha egyszer egy bizonyos genetikai beavatkozást
elkezdünk, akkor lehetetlen megakadályozni azt, hogy
az így szerzett ismereteket nemkívánatos emberi
képességek fokozására használhassák fel