TRİZOL RNA EKSTRAKSİYONU

DNA ve RNA Arasında

• RNA molekülü ilk bakışta DNA’ ya benzemesine
karşın en önemli farkı RNA’nın tek zincirli
oluşudur.
• Bu nedenle RNA DNA ’ya göre daha az stabil
yapıda ve dayanıksızdır.
• RNA’nın DNA’dan diğer farkları arasında
molekülünde Timin yerine Urasil yer alması ve
Pentoz şekerinde 2’ konumunda hidroksil grubu
içermesidir.
 RNA Molekülü
• Bir başka alternatif olarak RNA izolasyonu ve
ardından cDNA kütüphanesi oluşturulabilir.
• RNA izole edilecek canlıdan incelenecek
örneği çalışılıncaya kadar sıvı azot içerisinde
dondurulma aşaması yapılmalıdır.
• RNa izolasyonu bu derste detaylı olarak
anlatılacaktır.
 RNA İZOLASYONU

Deney için gerekli Kimyasallar

1. Trizol
2. Kloroform
3. İzopropilalkol
4. Etanol(%70’lik)
5. DEPC (Diethylrocarbonate) su
6. ddH2O
 Deney için gerekli Kimyasallar

6. Agaroz

7. Formamid

8. Etidium bromür

9. OPS (3-(N-Morpholino)propansulfonic
acid) solüsyonu
 Deneyin Yapılışı
• Her 4 ml Trizol başına 400-750 mg doku örneği
kullanılır ve örnek Trizol içinde homojenize edilir.
(Örnek Trizolün %10’undan fazla olmamalıdır.)
• Homojenizasyonun ardından 4ºC’de 10 dk
11000 devirde santrifüj edilir süpernatant alınır.
• 800 µl kloroform eklenir, tüplerin ağızları güvenli
bir şekilde kapatılır, 15 sn süreyle elle çok güçlü
bir şekilde çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dk
inkübe edilir.
 Deneyin Yapılışı
• İnkübasyondan sonra örnekler, 4ºC’de 15 dk
11000 rpm de santrifüjlenir supernatant alınır.
• Örneklere 2 ml izopropil alkol katılır ve oda
sıcaklığında 5-10 dk inkübasyona bırakılır.
• Örnekler 11000 rpm’de , 4ºC’de 15 dk santrifüj
edilir, üst faz tamamen uzaklaştırılır.
 Deneyin Yapılışı
• Alta kalan kısıma 4 ml %70’lik etanol ilave
edilerek hafifçe vortekslenir ve 8000 rpm’de
4ºC de 5 dk santrifüj edilir.
• Etanol uzaklaştırılır ve tüpler kurutma kağıdına
ters çevrilerek kurutulur.
• Örneğe 40 µl DEPC su ilave edilerek -80 ºC de
stoklanır.
 RNA için Jel Elektroferezin Hazırlanışı

Üç adımda gerçekleşecek olan jel elektroferezin

hazırlanması,
1. Jelde yürütülecek RNA örneğinin
hazırlanması
2. Jelin hazırlanması
3. Akabinde Küvet solüsyonun hazırlanması
vardır.
Jelde Yürütülecek RNA Örneğinin Hazırlanması

• RNA+ ddH2O= 4.5µl (1 µl RNA + 3.5 µl ddH2O)

• 0.5 µl 20xMOPS solisyonu

• 5 µl formamid

• 65 ºC de 15 dk inkübe edilir.
 Jelin Hazırlanışı

• 1.88 mml 20 x MOPS solüsyonu

• 0.3 gr Agaroz ve 28.5 ml ddH2O

• Kaynatma
• 37 ºC ‘ye kadar soğuyunca 6.68 µl Formamid
ekleme ardından etidium bromür eklenir.
• Jel donmaya bırakılır.
 Küvet Solüsyonu Hazırlanması
• 1 x MOPS solüsyonu kullanılır.

Jel Elektroferez
RNA’nın Agaroz Jel Elektroforezinde Kontrolü
pH’a göre nükleik asitlerin farklı fazlarda görünümü
Şekil 3: RNA'nın Fenol-Kloroform Ekstraksiyonu