Cеквенування ДНК

методом Сенгера
ВИКОНАЛА СТУДЕНТКА 12303П ГРУПИ
ПЕТРЕНКО ТЕТЯНА
 2

Секвенування ДНК - це процес

визначення послідовності
нуклеотидних основ (As, Ts, Cs і Gs)
в шматку ДНК. Сьогодні, при
правильному обладнанні та
матеріалах, секвенування короткого
шматка ДНК є відносно простим.

Sample Footer Text

 Метод був розроблений дворазовим
Нобелівським лауреатом Фредеріком
Сенгером і його колегами в 1977 році,
звідси і назва послідовності Сенгера.
 Хоча геноми в даний час зазвичай
секвенуються за допомогою інших
методів, які є швидшими і менш
дорогими, секвенування Сенгера все ще
широко використовується для
секвенування окремих фрагментів
ДНК, таких як фрагменти, що
використовуються при клонуванні ДНК
або генеруються за допомогою
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
 Секвенування Сенгера залишається широко
використовуваним у галузі секвенування,
оскільки воно пропонує кілька помітних переваг:
 економічну ефективність для секвенування
окремих генів
 точність 99,99%, особливо придатну для
верифікації секвенування для сайт-спрямованого
мутагенезу або клонованих вставок.
Секвенування Сенгера передбачає створення
багатьох копій цільової ділянки ДНК. Його
інгредієнти аналогічні тим, які необхідні для
реплікації ДНК в організмі або для
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), яка
копіює ДНК in vitro. Вони включають:
 Фермент ДНК-полімерази
 Праймер, який являє собою короткий
шматочок одноланцюгової ДНК, який
зв'язується з шаблонною ДНК і діє як
«стартер» для полімерази
 Чотири нуклеотиди ДНК (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP)
 Шаблонна ДНК для секвенування
Однак реакція секвенування Сенгера також
містить унікальний інгредієнт:
Дидезокси, або ланцюгово-термінуючі,
версії всіх чотирьох нуклеотидів (ddATP,
ddTTP, ddCTP, ddGTP), кожен з яких
позначений різним кольором барвника
 Дидезоксинуклеотиди схожі на звичайні, або
дезокси, нуклеотиди, але з однією ключовою
відмінністю: у них відсутня гідроксильна група на 3'
вуглеці цукрового кільця. У звичайному нуклеотиді
3' гідроксильна група діє як «гачок», дозволяючи
додати новий нуклеотид до існуючого ланцюга.
 Після того, як дидезоксинуклеотид був доданий до
ланцюга, гідроксил відсутній і більше нуклеотидів
не може бути доданий. Ланцюг закінчується
дидезоксинуклеотидом, який маркується особливим
кольором барвника в залежності від основи (A, T, C
або G), яку він несе.
Процедура

1. Підготовка шаблону:
 Копії шаблонного ланцюжка, що підлягає
секвенуванню, повинні бути підготовлені з
короткими відомими послідовностями в кінці 3'
ланцюжка шаблону.
 Праймер ДНК необхідний для ініціювання
реплікації шаблону , тому завжди потрібна
підготовка праймерів відомих послідовностей на
3'кінці.
 Для цього одноланцюговий вектор клонування
M13 фланкується шаблонною ниткою на 3'кінці,
яка служить місцем зв'язування ґрунтовки.
2. Генерація вкладеного набору мічених фрагментів:
 Копії кожного шаблону діляться на чотири
пакети, і кожна партія використовується для
різних реплікацій.
 Копії стандартного праймера і ДНК-полімерази I
використовуються у всіх чотирьох партіях.
 Для синтезу фрагментів, що закінчуються на А,
до реакційної суміші на партії I додають ддАТФ,
дТТП, дКТП і дГТФ, стандартний праймер і
ДНК-полімеразу I.
 Аналогічно, для генерації, всі фрагменти, які
закінчуються на C, G і T, відповідні ddNTP, тобто
ddCTP, ddGTP і ddTTP, додаються відповідно до
різної реакційної суміші на різних партіях разом
зі звичайними dNTP.
3. Електрофорез і гелеве зчитування:
 Реакційну суміш з чотирьох партій завантажують
в чотири різних свердловини на
поліакриламідний гель і електрофорують.
 Авторадіограма гелю зчитується для визначення
порядку основ комплементарної нитки до
порядку шаблонної нитки.
 Смуга найкоротших фрагментів знаходиться
внизу авторадіограми, так що послідовності
комплементарної нитки зчитуються знизу вгору.
 Правильне читання результатів секвенування
Сенгера буде залежати від того, яка з двох
комплементарних ниток ДНК представляє
інтерес і який праймер доступний. Якщо дві
нитки ДНК А і В і нитка А представляє інтерес,
але праймер краще для нитки В, вихідні
фрагменти будуть ідентичні нитці А. З іншого
боку, якщо цікавить пасмо A і грунтовка краще
для пасма A, то вихід буде ідентичний пасму B.
Відповідно, вихід потрібно перетворити назад в
пасмо A.
 Секвенування Сенгера дає високоякісну
послідовність для відносно довгих ділянок ДНК.
 Зазвичай він використовується для секвенування
окремих фрагментів ДНК, таких як бактеріальні
плазміди або ДНК, скопійовані в ПЛР.
 Однак секвенування Сенгера є дорогим і
неефективним для більш масштабних проектів,
таких як секвенування цілого геному або
метагеному («колективний геном» мікробної
спільноти). Для таких завдань нові,
великомасштабні методи секвенування є швидшими
та дешевшими.
Секвенування
наступного
покоління
 Назва може звучати як
«Зоряний шлях», але це
дійсно так називається!
Найновіший набір технологій
секвенування ДНК разом
називається секвенуванням
наступного покоління.
 Існує безліч методів
секвенування наступного
покоління, які
використовують різні
технології.
 Існує безліч методів секвенування наступного покоління, які використовують
різні технології. Однак більшість з них поділяють загальний набір
особливостей, які відрізняють їх від послідовності Сенгера:
 Дуже паралельний: багато реакцій послідовності відбуваються одночасно
 Мікромасштаб: реакції крихітні і багато можна зробити відразу на чіпі
 Швидко: оскільки реакції робляться паралельно, результати готові набагато
швидше
 Низька вартість: секвенування геному дешевше, ніж за допомогою
секвенування Сенгера
 Концептуально секвенування наступного покоління схоже на паралельне
виконання дуже великої кількості крихітних реакцій послідовності Сенгера.
Завдяки такому розпаралелюванню і малому масштабу, великі кількості ДНК
можуть бути секвеновані набагато швидше і дешевше за допомогою методів
наступного покоління, ніж за допомогою секвенування Сенгера.
Дякую за
увагу!