СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Спектрофотометрични
измервания
Абсорбционна спектроскопия.
Закон на Буге-Ламберт-Беер.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Взаимодействие на електромагнитните вълни с веществото

Когато (електромагнитна) вълна

минава през вещество, част от нея се
поглъща, част се разсейва, част
преминава през средата, част се
отразява от граничната повърхност
при навлизането във веществото.
Абсорбцията на ЕМ енергия е резултат от поглъщане на
енергията на фотона от материята (обикновено от електроните в
електронните обвивки на атомите). Така ЕМ енергия се
трансформира във вътрешна енергия на абсорбера, например
топлинна енергия. (Диаграма на Яблонски.)
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

S2
T2
вск вк

A
икк
S1
T1

A фл вк фф

S0
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

При разпространението на светлинните вълни през среда

тяхната интензивност постепенно намалява.
Поглъщането на Е обикновено не зависи от интензитета
(линейно поглъщане), но понякога прозрачността на средата
се променя с коефициент, който варира в зависимост от
интензивността на вълната, и настъпва наситено поглъщане
(или нелинейно поглъщане).
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Най-висока поглъщаща способност има абсолютното

черно тяло с k = 1.
Коефициент на поглъщане близък до този на черното тяло има
черната сфера от уредите за оценка на топлинно натоварване чрез WBGT
индекс. Някои материали в природата също имат високо поглъщане,
например саждите.
Пропускане на едно вещество:
t = I / I0
Обикновено се представя като процент: t = (I/I0)  100, %
Коефициент на поглъщане: k = 1–t = (I0 – I)/I0 =
Iпогълната/I0
Екстинкция на веществото или загасване, затихване
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Пример:
Слънчев филтър, пропускащ 1/100 000 част от светлината, т.е. с
отношение между интензитетите Iфилт. на преминалата през филтъра

светлина и Iслънч. на попадащата върху него слънчева:

t = Iфилт./Iслънч. = 1/100 000

Процентната му пропускливост t% ще бъде:
t% = (Iфилт./Iслънч.)  100 = (1/100 000)100 = 0.00001100 = 0.001%
Екстинкцията на филтъра ще бъде:
E = lg(1/t) = lg(Iслънч./Iфилт.) = lg 100 000 = 5
За филтрите вместо екстинкция, по-често се използва терминът
плътност. Този филтър има плътност 5.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Спектър на пропускане:
Зависимост на t от l
Използва се за характеристика на светофилтри, т.к.
формата на кривата зависи от [c] и l.

Спектър на поглъщане
Зависимост на E от l
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

The transmission and absorption spectra of silicon nitride films in the

range 200– 800 nm
https://www.researchgate.net/figure/shows-the-transmission-and-absorption-spectra-of-the-prepared-silicon-nitride-
films-in_fig1_283449137
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Figure 1. Reflectance (red) and

transmittance (blue) spectra of a fresh
Carolina poplar (Populus canadensis) leaf.
Канадска топола
Figure 2. Reflectance (red) and
transmittance (blue) spectra of a dry
Carolina poplar (Populus canadensis) leaf.
Канадска топола

http://photobiology.info/Jacq_Ustin.html
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Ако монохроматичен светлинен сноп с начална интензивност I0 измине

разстояние d в твърд полупрозрачен материал или в разтвор на някакво
вещество, то интензивността му ще спадне до стойност I, поради
частичното поглъщане на светлината от веществото.
Тази поглъщаща способност се характеризира с
коефициента на поглъщане (или абсорбционна константа) kl
за съответната дължина на светлинната вълна l, според зависимостта:
ln I – ln I0 = – kld
или спрямо I:

I = I0 e–kld
известна като закон на Буге-Ламберт-Беер.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Законът гласи, че съществува логаритмична зависимост

между пропускането на светлината през веществото
(или пропускливостта на веществото)
и произведението на коефициента на поглъщане на
веществото и разстоянието, което светлината изминава
през материала (т.е. дължината на пътя).
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Коефициентът на абсорбция от своя страна може да бъде записан

като произведение
 на моларната абсорбция на абсорбера и на концентрацията на
абсорбиращите вещества в материала,
 или на напречното сечение на абсорбцията и плътността (броя) на
абсорберите.
За течности тези отношения обикновено се изразяват с уравнението:

A = E = OD = lgI0/I = e l c
A – абсорбция
E – екстинкция
ОD – оптична плътност (Optical Density)
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

История

Два закона на поглъщане:

1. Всеки тънък слой с постоянна дебелина в еднородно оцветена среда
поглъща определена част от влизащия в него (светлинен) поток на
монохроматична радиация – Закон на Буге (1729) – Ламбер (1760).

2. Поглъщането от даден слой е пропорционално на броя на оцветените

молекули, намиращи се в него, а следователно и в единица обем, т.е. на
тяхната концентрация – Закон на Беер (1852).
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Разтворите често имат различна пропускливост за различните

дължини на вълната l, което дава информация за
концентрацията и вида на разтвореното вещество.
Например:
пропускливостта на бордолезов разтвор (разтвор на "син камък" във
вода) към жълтите и червените лъчи ще бъде намалена, поради
характерния му син цвят (действа като син светофилтър).

Колкото по-наситен е цветът,

толкова концентрацията на разтвореното вещество е по-висока.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Изследването на пропускливостта на разтворите позволява

да се съди за моларната им концентрация – брой моловете
разтворено вещество в единица обем от разтвора.

Количеството светлина, погълнато от разтвор с

моларна концентрация c се характеризира с
моларен коефициент = [lg(I0/I)]/cd,

където I0 е началната интензивност на попадащата в разтвора

монохроматична светлина, изминала
разстояние d в него, при което
интензитетът й е спаднал до стойност I.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Абсорбционната спектроскопия
включва редица техники, основаващи се на
взаимодействието на електромагнитното излъчване с материята
– сравнява се интензивността на лъча светлина,
измерен преди и след взаимодействието с пробата.
UV-видима спектроскопия – лесно и евтино измерване
колко светлина с определена дължина на вълната (цвят)
се поглъща / абсорбира от пробата.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Цветът често може да бъде свързан с присъствието

и / или структурата на дадено вещество 
абсорбционната спектроскопия се използва широко за
качествено (присъства ли химикал?) и за
количествено (колко ?) и
структурно (променен ли е?) определяне в много
области. Например, ДНК поглъща в УВ-диапазона 
количеството ДНК в пробата може да бъде определено
чрез измерване абсорбцията на УВ светлина.
Sr. Electromagnetic
Spectroscopic type
No Radiation

1 X-ray X-ray absorption spectroscopy

2 Ultraviolet–visible UV–vis absorption spectroscopy

3 Infrared IR absorption spectroscopy

Microwave absorption
4 Microwave
spectroscopy
Electron spin resonance
spectroscopy
5 Radio wave
Nuclear magnetic resonance
spectroscopy
https://en.wikipedia.org/wiki/Absorption_spectroscopy
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Екстинкцията на разтвор с концентрация единица

се нарича специфична екстинкция
на разтвореното вещество.

Като се измери екстинкцията

на разтвор с концентрация 1 M
при определена дължина на вълната,
може да се определи
моларният екстинкционен коефициент e
на разтворено в даден разтворител вещество.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

След като се знае e,

чрез измерване на екстинкцията
при подходяща дължина на вълната,
може да се определи
концентрацията на разтвор от същото вещество.

Така със спектрофотометрично измерване могат да се

определят концентрации на пигментни вещества като
хлорофил, каротиноиди, хемоглобин и др. в екстракти
от растителни или животински тъкани, както и
концентрации на редица неорганични вещества.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Спектри на поглъщане на хемоглобин и оксихемоглобин,

представени чрез моларния екстинкционен коефициент ε.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Екстинкцията се измерва с апарати, наречени

спектрофотометри.
Принципно устройство:

• Еднолъчев спектрофотометър

• Двулъчев спектрофотометър
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Основни елементи:
• Лампа:
• Волфрамова – VIS
• Деутериева – UV
• Монохроматор (или светофилтри) – разлага светлината:
призма или дифракционна решетка; заедно с лещи/огледала

• Държач за кювети
• Датчик – фотоклетка: фоторезистор, фотодиод
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Принцип на работа на Spekol 11, Carl Zeiss:

• Избира се режим на работа: τ%, E или c.
• Ъгълът на дифракционната решетка се нагласява на
желаната λ чрез микрометричен винт, разграфен в nm.
• В даден момент само една от двете кювети (с разтвор или
с разтворител) може да се намира под монохроматичния
светлинен сноп на прибора като кюветите се сменят лесно
и бързо чрез предвидено за целта устройство.
• Зад гнездото за кюветите е разположен фотоприемник,
електрическия сигнал от който се измерва и се показва на
цифровия дисплей във формат спрямо режима на работа.
• Преди всяко измерване приборът се нулира електрически
чрез специален бутон, така че τ% = 100% или Е = 0.
• При работа, с две последователни измервания се отчита
разликата в пропускливостта/екстинкицията на кюветата с
разтворител и на кюветата с разтвора.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Когато в един разтвор има няколко разтворени вещества,

определянето на концентрацията на всяко от тях също е
възможно, защото екстинкцията на такъв разтвор е сума
от екстинкциите на различните вещества, а
екстинкцията на всяко вещество е пропорционална на
неговата концентрация.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Концентрациите на две вещества в разтвора

могат да бъдат определени, ако се подберат
две подходящи дължини на вълната,
при които двете вещества имат различни и независими една
от друга специфични екстинкции.
След измерване на екстинкцията на разтвора
при тези две дължини на вълната
се съставя система от две уравнения,
която се решава по отношение на неизвестните концентрации.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Mетодът може да се обобщи за произволен брой вещества, но с

увеличаване броя на веществата нараства
броят на необходимите за провеждане на анализа измервания,
както и обемът на изчислителната работа
за намиране на концентрациите.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Два основни типа хлорофил – a и b,

различават се само по една група в състава на страничната
верига (–CH3 в Хл a, –CHO в Хл b).

https://dyna-gro.com/the-difference-between-chlorophyll-a-b-and-photosynthesis-overview/

хлорофил b

хлорофил a
https://en.wikipedia.org/wiki/Chlorophyll_a
https://en.wikipedia.org/wiki/Chlorophyll_b
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

И двата типа хлорофил са много ефективни

фоторецептори, тъй като съдържат мрежа от редуващи
се единични и двойни връзки и орбиталите могат да се
делокализират, стабилизирайки структурата.
Такива делокализирани полиени имат много силни
абсорбционни ивици във видимата област на спектъра,
което позволява на растението да поглъща ефективно
енергията от слънчевата светлина.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Различните странични групи в 2-та хлорофила „настройват“

абсорбционния спектър на малко по-различни дължини на вълните,
така че светлината, която не се абсорбира значително от хлорофил а,
460 nm, ще бъде уловена от хлорофил b.
Тези два вида хлорофил се
допълват взаимно при поглъщането
на слънчевата светлина.

Растенията покриват енергийните си

нужди от поглъщане в синята и
червената част на спектъра.
В зелената област на спектъра, около
500-600 nm, се абсорбира много малко
светлина – хлорофилът не поглъща,
тази светлина се отразява
 растенията изглеждат зелени.

The absorption spectrum of both the chlorophyll a and the

chlorophyll b pigments. The use of both together enhances
the size of the absorption of light for producing energy.
https://en.wikipedia.org/wiki/Chlorophyll_b
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Хлорофилът абсорбира толкова силно, че може да

маскира други по-малко интензивни цветове.
Някои от тези по-деликатни цветове (от молекули като
каротин и кверцетин) се проявяват когато молекулата на
хлорофила се разпада през есента и листата на дърветата
стават червени, оранжеви и златистокафяви.
Хлорофилът може да бъде повреден и при термична
обработка (готвене) на зелени листа, което води до
промяна на абсорбционния спектър и сварените листа
променят цвета си – стават по-бледи, жълтозелени и
често безвкусни.
СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

https://qforquestions.com/photosynthetic-pigments/photosynthetic-pigments-2/
СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

https://www.api.simply.science/images/content/biology/cell_biology/
photosynthesis/conceptmap/Photosynthetic_pigments.html
СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика
СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

https://www.researchgate.net/profile/Svetoslav_Anev2/
publication/314076424_Fiziologia_na_rasteniata_-
_rkovodstvo_za_uprazneniata/links/
58b85963a6fdcc2d14d99b41/Fiziologia-na-rasteniata-
rkovodstvo-za-uprazneniata.pdf
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Отклонения от закона на Буге-Ламберт-Беер

При определени условия се нарушава линейната зависимост

между абсорбцията и концентрацията на анализираното
вещество. Тези отклонения са класифицирани в три категории:

1. Реални – фундаментални
отклонения поради
ограниченията на самия закон.
2. Химически – наблюдавани
поради специфичната химична
природа на анализираните
вещества.
3. Инструментални – отклонения,
които възникват поради начина
на измерване на поглъщането.
https://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/beers1.htm
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Има определени условия, които трябва да бъдат изпълнени,

за да бъде валиден законът на Буге-Ламберт-Беер:

1. Поглъщащите вещества не трябва да взаимодействат

помежду си.
Разтворите трябва да са разредени – за да няма взаимодействие между
веществата (стойностите на екстинкцията не трябва да надвишават 1).

2. Абсорбиращата среда трябва да бъде хомогенна.

3. Абсорбиращата среда не трябва да разсейва лъчението

Да няма помътняване; стените на кюветите трябва да са сухи и
чисти.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

4. Падащата светлина трябва да бъде монохроматична.

5. Падащата светлина трябва да се състои от успоредни лъчи,
всеки изминаващ еднакво разстояние/дължина в
абсорбиращата среда.
6. Падащата светлина не трябва да взаимодейства с атомите
или молекулите в анализираната среда; той трябва да
действа само като неинвазивна сонда. Светлината не
трябва да причинява оптично насищане или оптично
изпомпване, тъй като подобни ефекти ще изчерпят долното
енергетично ниво и евентуално ще предизвикат
стимулирано излъчване.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Ако някое от тези условия не е изпълнено,

ще има отклонения
от закона на Буге-Ламберт-Беер.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Отклонения от закона на Буге-Ламберт-Беер

1. Законът е изведен, приемайки че молекулите на хромофорите са

разпределени равномерно.
Ако хромофорът не е равномерно разпределен  понижаване на Е.
Сравнете разпределението на хемоглобина в суспензия от
еритроцити и в хемолизат.

2. Законът приема, че e е константа и не зависи от [с].

Ако при повишаване на концентрацията се променя
взаимодействието между хромофорите (напр. настъпва агрегация
на молекулите), ще се променят и фотофизичните свойства, вкл. e.

3. Зависимостта на Е от с може да се отклони от линейната при

използване на немонохроматична светлина.
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Отклонения от закона на Буге-Ламберт-Беер

4. В разтвора не трябва да протичат забележими фотохимични

превръщания на хромофорите под действие на измерващата
светлина.

5. Интензивността на измерващия светлинен лъч трябва да е

ниска, за да не намалява концентрацията на невъзбудените
молекули в резултат на поглъщане на светлина в хода на
измерването.

6. Ако пробата не само поглъща, а и разсейва светлина, ще се

увеличи Е.

7. Луминесценцията пречи на точното измерване   E.

СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Имате ли въпроси?
СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

а н иет о!
за в н и м
а ря
Благод
 СУ, Биологически факултет, Катедра Биофизика и радиобиология – практически занятия по биофизика

Еспериментални задачи:

1. Измерете Е с мокри, мръсни и/или неправилно

поставени кювети, както и на неразбъркани разтвори.
2. Сравнете E при различно разпределение на
хемоглобина: в суспензия от еритроцити и в
хемолизат. Апарат: Боеко. – В кюветa сложете 1 ml PBS
буфер, а в друга – 1 ml дестилирана вода, добавете по 10 µl еритроцитна
суспензия (~Ht 20 %). Измерете Е413 на двете кювети.

3. Проверете зависимостта на Е от концентрацията на

хемоглобин (или хлорофил) в широки граници. Апарати:
Онда или Спекол. – За освобождаване на хемоглобин към 1 ml
дестилирана вода се добавят 40 µl еритроцитна суспензия (~Ht 20 %).
Подготвят се проби с краен обем 1 ml, които съдържат 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60
µl екстракт на хемоглобин. Измерва се екстинкция при 413 нм.
4.Измерете спектъра на поглъщане на хемоглобин или
хлорофил. Апарат: Боеко.
За освобождаване на хемоглобин към 1 ml дестилирана вода се добавят 40
µl еритроцитна суспензия (Ht 70 %). За измерване на спектри към 2 ml
вода се прибавят 20 µl екстракт на хемоглобин.

За приготвяне на пигментен извлек от тилакоидни мембрани към 1 ml

ацетон се прибавят 100 µl тилакоиди. След ресуспендиране и инкубация
от 5 min при стайна температура, суспензията се центрофугира за 1 min
при 12 000 rpm за утаяване на мембранните фрагменти. За измерване на
спектри към 2 ml разтворител (ацетон) се прибавят 100 µl екстракт.

5. Измерете Е на ацетонов пигментен извлек от

тилакоидни мембрани на спанак (Spinacia oleracea), за
да изчислите концентрацията на хлорофил a, хлорофил
b и каретониди в изходния разтвор по Лихтенталер
(1987). Апарат: Спекол.
Лихтенталер
(1987)