Összegző ismétlés

Dr. Porrogi Pálma

A teljes félév során elméleti és gyakorlati ismeretek összefoglalása. Az eukarióta sejt felépítése. Az egyes
sejtalkotók szerkezete és feladatai. Sejtek, sejtalkotók kimutatási technikái. Citológiai, citokémiai reakciók.
Mikroszkóp technikák. Sejten belüli folyamatok.
Elmélet és Gyakorlat

Elmélet Gyakorlat

Az egyes sejtalkotók részletes felépítése és Mikroszkóp technikák:

működése -fénymikroszkóp
-sejtmembrán -elektronmikroszkóp (TEM, SEM)
-sejtmag -fluoreszcens mikroszkóp
-ER: DER, SER -mikrotechnológiai lépések
-Golgi-apparátus
-citoszkeletális vázrendszer Citológiai festés: HE, toluidin-kék
-endoszóma-lizoszóma
-mitokondrium, peroxiszóma Citokémiai reakciók:
-Feugen reakció (DNS)
Sejttani folyamatok: -Aoyama kimutatás (Golgi)
-transzkripció és transzláció -PAS-reakció
-vezikuláris transzport -Tri-PAS festés
-sejtek közötti kapcsolatok Immuncitokémia:
-sejtciklus -humán inzulin kimutatás
-sejtosztódás Enzimcitokémia: Gömöri-féle
-sejtek öregedése
-sejtek halála LM és EM képek felismerése, elemzése
A citológiai kémiai festések elve

A citológiai festéseket, citokémiai reakciókat vagy metszeteken, vagy még a metszés, beágyazás
előtt a fixált mintán lehet elvégezni.
 Cél: Sejtorganellumok/intercelluláris állomány láthatóvá tétele. Lehet aspecifikus/specifikus

Auxokróm csoport

Festék molekula

Anion, oldatban savas Kation, oldatban bázikus

Kation (fehérje) Anion (nukleinsav vagy savas fehérje)

Acidofil Bazofil

Festett makromolekula
Hepatocyta metszet
Citoplazma (E)
Sejtmag (H)

Igen
hepatocytak
5%-nak 2
smagja van Intercelluláris tér

Magvacska (H)
PATKÁNY MÁJ metszet. Hematoxilin - eozin festés.
 LIMFOID LEUKÉMIÁS VÉRKENET. MGG
(May-Grünwald, Giemsa) festés

limfocita

vvt

Honnan tudja, hogy nem normális, hanem

leukémiás (pathológiás) a vérkenet?
Hol alkalmazunk MGG festést? 5
!! FM és EM összegző táblázat !!

6
SEM (balra) és TEM kép (jobbra) összehasonlítása

Limfociták

7
A sejtmag (nucleus) felépítése
Az Eukarióta sejt fő jellemző sejtalkotója.
Gömb alakú (2-20 µm). Elhelyezkedése: sejttípustól függő: centrális, basalis, perinukleáris..

1. Sejtmaghártya: külső + belső lemez; közte perinukleáris tér

2. Magpórus komplex: szelektív anyagáramlás biztosítása cp és mag között, gyűrű komplex
3. Kromatin állomány: kondenzált DNS, eu- és heterokromatin
4. Nukleolusz: rRNS szintézis, szabályozás
5. Interkromatikus állomány: benne magmátrix (citoszkeletonhoz hasonló) + magnedv

Maghártya és ER kontinous folytatásban,

terei ugyancsak átjárhatóak
A sejtmag mikroszkópos megjelenése

limfocita (MGG, FM) limfocita (TEM)

9
A sejtmag szerkezete (TEM)

lamina
fibrosa

maghártya

pórus

Perifériás
hetero-
kromatin

10
A magvacska
részei magvacska

mag-
hártya
magvacska

FC
DFK

GK

FC: fibrilláris centrum (pars amorpha, NOR)

DFK: denz fibrillaris kompartment (pars
fibrosa),
GK: granuláris kompartment (pars
granulosa) 11
A magvacska funkciója
Latin név Angol röv. Funkció

! !
Pars amorpha FC NOR
45S rRNS szint
Pars fibrosa DFC rRNS érés
Pars granulosa GC Riboszóma alegységek összeépülése
Pars chromosoma Associated hetero-
chromatin
Nem funkcionális része a magvacskának

FC: fibrilláris centrum

DFC: dense fibrillar compartment
GC: granular compartment

12
1. DNS azonosítás Fuelgen
reakcióval
1) 1. HCl hidrolízis
- RNS feloldódik
- purin bázisok lehasadnak a
HCl DNS-ről
- aldehid csoportok
keletkeznek

2. Aldehid csoportok
DNA Schiff reagens - pink
2) Schiff reagens (leukofukszin)
+

Pink (lila) fukszin

 Schiff teszt
(aldehid csoport „maradékok” azonosítása)

Fukszin Schiff reagent Fukszin

(leukofukszin)
Shiff-reagens alakalmas valamennyi aldehid csoport
kimutatása általi koncentráció számításra: 0% 5% 10%
Ld. Lambert-Beer törvény Abs= Ɛ * c* l
Ɛ: moláris extinciós koefficiens [M -1cm-1), c: Koncentráció [M]; l: fényút [cm]
 Sejtmag

Citoplazma

[15] Patkány máj. Feulgen reakció.

Vörös reakciótermék (bázikus fukszin) a sejtmagokban (DNS).
15
[4] Máj (H ) [8] Máj (HE) [15] Máj (Feulgen)
Endoplazmatikus retikulum (ER)
Membránnal határolt háromdimenziós üregrendszer a citoplazmában
Durva felszínű –DER-
(garnuláris ER)
• Lapos vagy tágult zsákok
(ciszternák)
• melyek kapcsolatban állnak
a magmembránnal, egymással
és a SER-rel is
• Felszínükön riboszómák
Sima felszínő -SER-
(agranuláris ER)
• Tubulusok (csövek)
• látszólag szabálytalan
rendszere
• melyek kapcsolatban
állnak egymással és a
DER-rel is
17
Endoplazmatikus retikulum hálózat – EM kép -
riboszómák

SER

a DER ciszternái

SEJTMAG
magpórus
heterokromatin

eukromatin 18
Fehérjeszintézis és transzport

19
Ergasztoplazma* 3

Granuláris DER

2
Az DER szerepe kiemelkedő a
szekréciós sejtekben is, ahol
ergastoplazmának is hívják.

4 1
* Citoplazma bazofíliát okozó
(nagymennyiségű) DER

1 = mitokondrium
2 = szekréciós szemcse
3 = Golgi
20
4 = dER TEM: ultravékony metszet
Nissl-szemcse

A DER szigetszerű elhelyezkedése az

idegsejtekben

Nissl-szemcse
Nissl-szemcse

Az idegsejtre leginkább jellemző plasmaalkotórész a „kromatikus” állomány vagy

Nissl-szubsztancia (a Lenhossék Mihály ajánlotta „tigroid” kifejezés sajnos
mindinkább feledésbe merül). A Nissl-szubsztancia (Nissl-rögök) valójában
21
ergastoplasma, tehát fehérjeszintetizáló sejt-szervrendszer.
 poliriboszóma

sejtmag
Tágult DER
ciszternák

durvafelszínű endoplazmás retikulum

maghártya

plazmamembrán (sejthatár) 22
Citoplazma bazofília típusai

Acidofil cp
Bazofil sejtmag

Diffúz Polarizált Rögös

Plazmasejt Pancreas exokrin Motoneuron

mirigysejtjei -acinus
Fehérje termelő
mirigysejt (polarizált)
• Pl. Pancreas (exocrin) acinus
(mirigyvégkamra)sejt: sok DER és
szekréciós szemcsék
• A fekete nyilak: bazoapikális áramlás.
• A szekrétum kondenzálódik a
szekréciós sejtek érése során.

24
[13] Hasnyálmirigy metszet, hematoxilin-eozin festés (HE)

1: sejtmag
2: bazofil
citoplazma
1 3. acidofil
(eozinofil)
1 2 citoplazma

2
Acinus

3 Belső
elválasztású
Langerhans
sziget

A preparátum célja a polarizált citoplazma bazofília

megfigyelése.
25
A DER immunfloureszcens festés (+magfestés)
lézer konfokális mikroszkóp (LCM)

Zöld: Protein disulfide

isomerase family a,
member 3

Kék: sejtmag (DAPI)

Milyen DER funkcióval

kapcsolatos a fenti
fehérje?

26
A Golgi-apparatus polaritása

=képződési felszín

diktioszóma

endoszóma

endoszóma
= leválási felszín

27
A Golgi apparátusban
történő folyamatok
összegzése

Lizoszómális enzimek kiválogatása

28
Vezikuláris transzportfolyamatok

Anterográd transzport: ER  Golgi  PM

Retrográd transzport: PM  Endo-lizoszómális

rendszer

Vezikuláris tubularis claster

A sejt fehérje forgalmának általános vázlata

• Kék: kapuzott transzport
• Zöld: vezikuláris transzport
A Golgi-készülék kompartmentjei
és a közöttük közlekedő vezikulák típusai – mikrotubuláris
• Piros: transzmembrán fehérje transzport
filamentumok mentén történő transzport (motorfehérje kapcsolattal)
Golgi kimutatása EM-el

• Fagyasztva törés
– TEM

• Fagyasztva
maratás -SEM

30
AOYAMA ezüst impregnáció technika Golgi FM
kimutatására
1. A ganglionmintát CdCl2-t tartalmazó formalinban rögzítjük, amely
agriofillá teszi a Golgi-membránokat.
2. Ezután a szövetet AgNO3-al impregnálják, és a Golgi-membránok
hajlamosak megkötni az Ag+-ionokat.
3. A következő lépésben az Ag+ ionjait hidrokinon fekete fémmé –elemi
Ag0-é redukálja.
4. A metszeteket beágyazás és metszés után utófestik Orange G – vel és
Safranin-nal.

A perikarion megjelenési sémája:

Ag  Golgi
Orange G  citoplazma
Euchromatikus sejtmag
Safranin  sejtmagvacska
 Metszet 3. Ganglion spinale- Aoyama ezüst impregnáció

Mellék/műtermék
Ezüst impregáció Golgi (1)
Orange G  cytoplasma
Euchromatikus nucleus (2)
Safranin  nucleolus (3)
A Golgi szerepe a klasszikus szekrécióban
Kontitutív szekrécióra szánt
ürülő folyékony fehérje
komponensek
Újonnan szintetizált Konstitutív
plazmamembrán lipidek szekréció (minden
Constitutive
sejtben: membrán
secretion or
komponensek, ECM)
exocytosis

Újonnan szintetizált
plazmamembrán fehérjék

Idegi vagy
hormonális inger

Szignál transzdukció Regulált szekréció

(ingerfüggő exocitózis
Regulated
(mirigysejtekben,
neuronokban:
secretion hormonok,
or
neurotranszmitterek,
exocytosis
enzimek. A szekréciós
szemcsék raktározódnak a
Fehérjéket és más vegyületeket sejtben.
tároló szekréciós vezikula 33
Szekretáló sejtek Polaritása

Hízósejt: Az egész felszínén ürül a Kehelysejt: az apikális

póluson történik az exocitózis
szekrétum.
Nem- polarizált Polarizált 34
[33a] Pancreas félvékony metszet, Toluidinkék

sejtmag

Acinus
(mirigy-
vég- szekréciós vezikulumok (zimogén
kamra) szemcsék) (a citoplazmában a sejt
apikális részén)
35
vezeték A preparátum célja: A zimogén szemcsék megfigyelése.
Kehelysejtek

FM metszet TEM metszet SEM

G= Golgi, SG= szekréciós granulum, 36

R= DER, M=mikroboholy
Biogén amint (pl. hisztamin) termelő hízósejtek
[11]
az akkumuláció és a degranuláció fázisában

37
[11] Patkány peritoneális folyadék, vastagcsepp-
preparátum, TK

1: hízósejtek:
(metakromázia!)
Akkumuláció (jobb)
és degranuláció (bal)
(ingerfüggés: allergén)

2: limfocita
degranuláció akkumuláció
sejtmagok

A preparátum célja: a vastagcsepp preparátum, a metakromázia, a

hízósejt munkaciklusának és a szekréciós szemcséknek a
megfigyelése. 38
Szteroid hormont szintetizáló sejt
részlete 39
Direkt és indirekt Immuncitokémia
Jelölés: enzimmel Detektálás: enzim-szubsztrát reakció kiváltott színreakció

Enzimmel
konjugált
szekunder
ellenanyag
Enzimmel
konjugált primer Nem jelölt primer
ellenanyag ellenanyag
Humán inzulin Immuncitokémiai kimutatása

Egér anti-humán inzulin ea. Ló anti-egér ellenanyag

Humán inzulin

Marker = enzyme

HRP (Torma peroxidáz)

Metszet 31.Human pancreas, endokrin Langerhans
szigetek, inzulin termelő -sejtek, indirekt
immuncitokémiai kimutatás

Metilénkék háttérfestés

100 x 400 x
Inzulin termelő sejtek konfokális fluoreszcens
mikroszkóppal való kimutatása (beta-TC-6)

beta-TC-6 sejtek Kontrol sejtek

HeLA sejtek
Inzulin (zöld)
Aktin filamentumok (piros)
DNS (kék)
A legismertebb sejtvonalak
HeLa (a legismertebb humán sejtvonal)

CHO=Chinese hamster ovary, kínai BHK=Baby hamster kidney, embrionális

hörcsögpetefészek sejtvonal hörcsögvese sejtvonal

44
VeRo=majom veseszövet
Mi a konfluencia?
Hayflick-szabály?
Kontakt gétlás?

45
Endolizoszómális rendszer „helye” és szerepe a vezikuláris
transzportban

 Citoplazma (nincs szignál)

 Sejtmag (NLS)

!
 Mitokondrium (N-term.
pozitív töltésű as. szignál)
 Peroxiszóma (C-term szignál)

Sejten kívüli anyag 46

Endocitózis típusok

-receptor független
-receptor-mediált

Endocitózis
Fagocitózis Pinocitózis

Intercelluláris folyadék

Vezikula
Fagoszóma
(táplálék vakuolum)
47
Az Endocitózis fő formái
Receptor
Receptorral nélkül Receptorral Receptor nélküli
vagy anélkül

48
 Rezecptor-mediálta endocitózis

Hol van még Klatrin burkos vezikulumnak szerepe?  Lizoszómális emésztőenzimek szállítása
M6P-Rezeptor – Klatrin  Reciklizáció M6P-R a TGN-be
Fagocitózis in vitro vizsgálata 1.

Natív (festetlen) preparátum

(fáziskontraszt mikroszkóp)
50
Fagocitózis in vitro
vizsgálata (FM)

Tesztszemcsék

Kármin szemcsék endocitózisa

Neutrálvörös szemcsék endocitózisa

51
Autofagoszóma

mitokondrium izolációs membrán

Peroxi-
szóma

52
[36] Emberi nyirokcsomó, HE Anthracosis (korom felhalmozódás)

Anthracosis: A szén
(korom)
felhalmozódása a
nyirokcsomókban,
gyakrabban
intrapulmonális
nyirokcsomókban,
szénpor, füst vagy
légszennyezés miatt.

53
 Energy storing and expending

High energy level MACROMOLECULES

Yolk Glycogen Lipid droplets

Amino acids Glucose-P Lipids

Glucose 1-P / 6-P Triglycerols (neutral lipids)

Glycolysis
Ac-CoA Cytosol

Mitochondrion
Biological oxidatiton

Citric
acid Biochemical pathways and
cycle connections between that
to produce energie in the
Terminal cell.
ATP
oxidation
54
 Negative lipid staining
(Adipose tissue HE)

The used organic solvent dissolve the lipids  so they are white
anti-lipid droplet
adipocytes 55
Negative and positive lipid staining in cell cultures

HeLa monolayer MGG

CHO monolayer Oil Red O+H
2: Dissolved lipid
1: lipid droplets, 2: nucleus

Do not use organic solvent and was added

Both cell lines produce steroid hormons chemical dye (Oil Red) and the background
staining was HE 56
 Positive (stained) lipid

The samples were frozen (physical fixation) then sectioned by microtome

(no organic solvents were used)

Stained by Oil Red O Sudan Black

57
http://www.vetmed.vt.edu/education/curriculum/vm8054/labs/lab2/examples/exlipidstains.htm
 Lipid droplets (TEM)

The content of lipid

droplets (LD) was Tubular
dissolved mitochondria
completely
during
dehydration (e.g.
acetone)

SER, LD, tub.

Mitochondria
Anti-lipid droplets are usually
are visiable associated in
steroid
hormons
58
secreted cells
 hexose PAS (Periodic acid - Schiff)
1.
reaction
Alcoholic OH

1) Periodic acid (PA) oxidez vicinal hydroxyl groups

into aldehydes in hexose of complex
carbohydrates –acidic hydrolysis-
2) Aldehyde groups give red colour with Schiff
reagent
H

2.


+ H2O
R-CHO +
aldehyde

Schiff-reagent Coloured
(leukofuchsin)
product
59
Hexose containing complex carbohydrates (e.g. glycogen, glycocalyx, basal membrane)
PAS reaction (cytochemical reaction) on liver
section

60
1:nucleus, 2: glycogen
 Glycogen granules in hepatocytes (TEM)

SER

Mitoch.

Glycogen

61
 Mitochondrion

Inner membrane
invagination
Double membrane: Outher and –lamelar/fletted
inner membrane=crista

• The inner membrane is highly folded into tubular or lamellar

cristae, which crisscross the matrix.
• The dense matrix, which contains most of the mitochondrial
protein, appears dark in the electromicroscope
• The intermembrane space and the crista space appear light
due to their lower protein content. 62
Phasecontrast microscope Mitochondria are visible in
light microscope.

Semithin section

Paraffin section

LM
LM

Janus Green B (redox dye) is a

vital stain to specifically
visualize mitochondria in living
cells. It changes colour
according to the amount of
oxygen present. When oxygen is
present, the indicator oxidizes to a
blue colour. 63
 Principle of the MTT Cell Viability Assay

Mitochondrial
dehydrogenases

NADH + Tetrazolium +  NAD+ + Formazan

MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide.

64
MTT-formazan crystals in cells and
after solubilization

Living cell

Dead cell

Apoptotic cell

Quantification by optical density

measurement at 570 nm

65
 Az apikális hámsejtfelszín képletei
Felszínnövelő struktúra: A mikrobolyhok (microvilli)
Sejtburok/Glykokálix/

Burkos
gödör

Hosszmetszet, TEM Keresztmetszet, TEM

66
Mikrobolyhok
(micrivilli) és csillók
(cilia) összehasonlítása

Sztereocilia: Nem mozgatható

felszíni módosulások a sejtek
apikális részén, a mikrovillusok közeli
rokonai. Hosszabbak egy átlagos
mikrovillusnál, aktin filamentumokat
tartalmaznak. Legjellegzetesebb
példája a belső fül szőrsejtjeinek
stereociliumai.

67
A laterális hámsejtfelszín képletei

68
A laterális hámsejtfelszín képletei

Microvillus
Sejt 1

Zonula occludens

Elektrodenz
plakk
Zonula adherens

dezmoszóma

Elektrodenz
plakk
Sejt 2 69
 Fokális kontaktusok (FM)
Fokális kontaktus

N
Aktin köteg

70
A bazális
Hámok hámsejtfelszín
basalis képletei
speciálizációi: 1) Basalis csíkolat

Lamina
basalis
Kapilláris
lumen
 Tri-PAS festés

• PAS (Perjódsav-Schiff) (Részleteket lásd másik

gyakorlaton!)
Hexóz tartalmú összetett szénhidrátok (glikokalix,
lamina basalis): bíbor-rózsaszín
• hematoxylin: barna magfestés
• Narancs-G (Orange-G): narancssárga citoplazma

72
[19] VESE (triPAS)

73
 19. VESE (triPAS)

1 2

4 5

1: kefeszegély; 2: bazálmembrán; 3:
citoplazma; 4: sejtmag; 5: lumen 74
A Sejtciklus fázisai
Egy sejtosztódás befejezésétől a következő sejtosztódás befejezéséig
Howard és Pelc, 1954, Mitchison, 1972, Paul, 1982, Zetterberg 1986, Pardee, 1994
Az MPF általi szabályozás

AZ MPF stimulálja a sejt M fázisbavaló lépését. Foszforilálja a lamina fibrosat (lamin A,

B, C)  setmaghártya lebomlik
Kromoszóma kondenzáció: H1 foszforilációja
MPF szubsztrátja MAP (mikrotubulusokhoz asszociált protein) is  mikrotubulus rendszer
osztódó sejtre jellemző struktúrává való átalakulása
Centriolumok szerkezete

Centriólum
pár

Mikrotu-
bulus
tripletek

A centrólumpár két tagja egymásra merőlegesen helyezkedik el.

A centroszóma (PCM) a sejtosztósban lényeges, a centriólumok a bazális testek képzésében.

Profázis
A testvérkromatidákat
kohezinek tartják össze a
replikálódott
kromoszómákban.

magmembrán
kromoszóma kondenzáció
állati sejtek legömbölyödnek

nucleolus
 Metafázisos mitotikus orsó

2
1

1: Mikrotubulusok; 2. Kromoszómák; 3. Centriólumok

Osztódó sejt (metafázis). 1 = kromoszómák
Anafázis

A kromoszómák/kromatidák vándorlása a pólusok felé

mikrotubulusok kromoszóma
Telofázis és citokinézis
A magmembrán újraszerveződik, citoplazma osztódik
heterokromatin

Középtest
(midbody)

magmembrán
mikrotubulusok
Citokinézis Kontraktilis gyűrű felelős az állati sejtek citokinéziséért

A poláris mikrotubulusok
átfedő régiójából jön létre aktin
Mikrotu- Középtest
bulusok (midbody)

Kontraktilis
gyűrű

miozin
 Sejthalál típusok

Aponekrózis

A passzív sejthalál
esetében a sejt halálát
az okozza, hogy hirtelen
az élettel teljesen
összeegyeztethetetlen
körülmények közé
kerül, s az őt ért
hatásokra nincs is ideje Az aktív sejthalál egy olyan sejtélettani
reagálni válaszreakció, amely a citoprotektív folyamatok
legvégső „öngyilkos” stációja, ahonnan84nincs
visszaút.
A kromatin kondenzáció és és mag fragmentálódás
(TEM)

Nekrózis (lízis) Apoptózis

(heterokromatin marginalizációja)

85
Membránfodrozódás
(SEM)

Apoptózis: 86
zsugorodás
 Zsugorodás és membrán
fodrozódás (sejttenyészet,
SEM)

1
kontroll

3
1: mitotikus telofázis 2

2: zsugorodott sejt 4

3: membránfodrozódás

4: apoptotikus test

apoptotikus 87
Kromatin kondenzáció és
fragmentálódás
(karyorrhexis) (TEM)

Normál sejtmag

Marginalizácó

Kondenzált DNS a mag bizonyos

oldalán lokalizálódik

88
 Kromatin kondenzáció
(heteropyknosis) és
magfragmentáció
(karyorrhexis)

(FM)

Endonukláz
Kaszpáz aktivitás

DNS kondenzáció és
sejtmag fragmentáció

89
Foszfatidilszerin
externalizáció
kimutatása

(affinitáscitokémia)

90
 Membránfodrozódás és magfragmentáció

Milyen
módszerrel
készült a kép?

DNA blue
Tubulin red
Golgi green
38. Emlőtumor sejtvonal, MGG

Fragmentálódó sejtmag

Apoptotikus testek

92
 38. Emlőtumor sejtvonal, MGG

Apoptotikus testek Heteropiknózis

Zsugorodó
sejtek

Magfragmentáció

93