Behcet

Ερευνητικό θέμα

WHO knows
 Περίληψη
Genome-wide association studies (GWAS):
Είναι ένα ισχυρό μέσο αναγνώρισης γονιδίων με κοινές παραλλαγές που σχετίζονται με
ασθένειες, αλλά δεν είναι κατάλληλες για την ανίχνευση γονιδίων με σπάνιες και χαμηλής
συχνότητας συνδυασμένες με ασθένειες παραλλαγές. Στην τρέχουσα μελέτη της νόσου
Behçet (BD), μη ανιχνεύσιμες παραλλαγές (NSVs) ταυτοποιήθηκαν με βαθιά εξωντική
επανεξέταση 10 γονιδίων που βρέθηκαν από GWAS (IL10, IL23R, CCR1, STAT4, KLRK1,
KLRC1, KLRC2, KLRC3, KLRC4 και ERAP1) 11 γονίδια που επιλέχθηκαν για το ρόλο τους
στην έμφυτη ανοσία (IL1B, IL1R1, IL1RN, NLRP3, MEFV, TNFRSF1A, PSTPIP1, CASP1,
PYCARD, NOD2 και TLR4) αξιολογήθηκαν για συσχέτιση BD.
 Εισαγωγή
Σύνδρομο Behcet

- Hulusi Behcet (1937)

- Αυτοφλεγμονώδης ασθένεια => αγγειίτιδα (κάθε μεγέθους αγγεία!) σε
απάντηση προς μολυντικο παράγοντα
- Συμπτώματα:
● Αφθώδη έλκη (κυρίως στόμα / γεννητικά όργανα)
● Ραγοειδίτιδα
● Μόλυνση / πληγές δέρματος
● Σπάνια: Μόνιμη τύφλωση, εγκεφαλικό επεισόδιο, καρδιακή προσβολή
- Γεννητική προδιάθεση: Silk Road (Ν και ΝΑ Ασία - Ν Ευρώπη)
 Εισαγωγή? Νομίζω οχι
Προηγούμενες έρευνες:

● GWAS (Remmers, Mizuki et al 2010), συχνές παραλλαγές:

- HLA B*51 (επιβεβαίωση)
- MHC Class I
- IL10
- IL23R

● GWAS (Kirino et al 2013)

- CCR1
- STAT4
- ERAP1
● Απορία προηγούμενων ερευνών: Εμπλέκεται η έμφυτη ανοσία;
● Κλινικές ενδείξεις
● Γενετικές ενδείξεις 🗙
 Εισαγωγή?
Γονίδια:

● IL23R => Υποδοχέα ιντερλευκίνης 23 (Εξ. Μεμβράνη Τ cells, NΚ, δενδριτικά)

IL23: κυτοκίνη, συνδεση με υποδοχέα > ουσίες φλεγμονής
● NOD2 => Διαμεμβρανικη πρωτεΐνη NOD2 (δενδριτικα, μακροφαγα, μονοκ.)
-ενεργοποιεί NfKβ > ρύθμιση γονιδίων φλεγμονής, παραγωγή κυτοκινών
● TLR4 => Διαμεμβρανικη πρωτεΐνη, αναγνώριση LPS (Gram-, κάποια Gram+)
-ενεργοποίηση έμφυτης ανόσιας
● MEFV: Γονίδιο που παράγει τη ουσία πύρινη, η οποία καταστέλλει τη
φλεγμονώδη αντίδραση. Μεταλλάξεις στο γονίδιο => Οικογενής Μεσογειακός
Πυρετός (FMF)
● CCR1 => Τύπου Ι υποδοχέας C-C χημειοκίνης > επιστράτευση κυττάρων
έμφυτου ανοσοποιητικού στο σημείο φλεγμονής
 Αποτελεσματα
1ο Στάδιο: 766 Ιάπωνες ( 382 ασθενείς - 384 υγιείς)

Εξετάστηκαν 21 γονίδια ( 10 GWAS - 11 έμφυτης ανοσίας)

Τα δείγματα των εξεταζόμενων υπέστησαν:

1) DNA Pooling (διαχωρισμός σε 16 DNA Pools με 48 δείγματα το κάθε pool)

2) PCR (1 PCR ανά DNA pool)

3) Συνδυασμός + Sequencing ανά pool (Genome Analyzer IIx)

4) Ανάλυση των ταξινομημένων (sequenced) δεδομένων (CASAVA 1.6)

5) Επαλήθευση δεδομένων (TOF MS) [528 ασθενείς - 586 υγιείς]

6) Ανάλυση για σπάνιες και χαμηλής συχνότητας μεταλλάξεις (MAF </= 5)

 Αποτελέσματα
1ο Στάδιο:

7) Στατιστική ανάλυση:

Δεν υπάρχει μια στάνταρ μέθοδος για προσδιορισμό των σπάνιων (MAF < 1) και
χαμηλής συχνότητας (MAF <5) μεταλλάξεων => 3 burden tests.

Κριτήρια για συσχέτιση με την ασθένεια:

- Τουλάχιστον 1 burden test με σημαντική συσχέτιση (p<0.0024)

- 1 «συναινετικό» burden test με ονοματική σημαντικότητα (p<0.05)
 Αποτελέσματα
1ο Στάδιο: Εξετάστηκαν 82 NSVs.

C-alpha Test

Σημαντική συσχέτιση: IL23R (5 NSVs)

Ονομαστική σημαντικότητα: TLR4 (6 NSVs) , IL1R1 (3 NSVs)

2 «Συναινετικά» (Data adaptive sum test, Step up test):

Σημαντική συσχέτιση: IL23R

Ονοματική σημαντικότητα: IL1R1

*NOD2: Απέκτησε ονοματική σημαντικότητα μετά από φιλτράρισμα. Όλα τα NSVs

του NOD2 ήταν και σπάνια (n=6)
 Αποτελέσματα
2ο Στάδιο: 768 Τουρκοι (384 ασθενείς - 384 υγιείς)

Εξετάστηκαν 14 γονίδια:

-10 GWAS

-3 αυτοφλεγμονωδων οδών ( TLR4, IL1R1, NOD2)

-MEFV

Ίδια μέθοδος με Στάδιο 1, έγινε στατιστική ανάλυση σε 1933 ασθενείς και 1872
υγιείς.
 Αποτελεσματα
2ο στάδιο: Εξετάστηκαν 97 σπάνια και χαμηλής συχνότητας NSVs

C alpha test:

Σημαντική συσχέτιση: IL23R (11 NSVs)

Ονοματική σημαντικότητα: TLR4 (11 NSVs), NOD2 (26 NSVs)

«Συναινετικά» Test: Επαληθεύουν τα αποτελέσματα του C Alpha Test. (IL23R και

TLR4 => p<0.05)

*IL1R1 δεν βρέθηκε οτι σχετίζεται με την ασθένεια στον τουρκικό πληθυσμο
 Αποτελέσματα
● Περαιτέρω ανάλυση ΜΟΝΟ των βλαβερών NSV:

=> Βελτίωση της σημαντικοτητας για IL23R, TLR4, NOD2.

=> Σπάνιες βλαβερές NSVs TLR4, NOD2: Ονοματική σημαντικότητα

● Μετα-ανάλυση των δεδομένων των C Alpha Tests και των 2

πληθυσμών:

Σημαντική συσχέτιση: IL23R, TLR4 (!)

Ονοματική σημαντικότητα: NOD2

*Επαληθευτηκαν από τα data adaptive sum και step up tests.

 Αποτελέσματα
MEFV: Γονίδιο που παράγει τη ουσία πύρινη, η οποία καταστέλλει τη φλεγμονώδη
αντίδραση. Μεταλλάξεις στο γονίδιο => Οικογενής Μεσογειακός Πυρετός (FMF)

C Alpha test: Σημαντική συσχέτιση NSVs (25) του MEFV με την BD.

● ΜΟΝΟ μια παραλλαγή του MEFV σχετίζεται με την Behcet:

Met694Val: Φλεγμονώδεις καταστάσεις (αμυλοειδής εναπόθεση, φλεγμονώδης

εντερική νόσος, αγκυλοποιητικη σπονδυλαρθριτιδα)

*Δεν βρέθηκε στους Ιάπωνες / ούτε συσχέτιση MEFV-BD

*Τουρκοι: Σημαντική συσχέτιση ακόμα και σε ετερόζυγη κατάσταση.

Θέσεις NSVs στο NOD2:

Ιάπωνες: Κοντά στο NACHT (δομή νουκλεοσιδικής τριφωσφατάσης)

Τούρκοι: Κοντά στο LRR (δομή επαναλήψεων πλούσιων σε λευκινη)

Πιθανόν ευθύνονται για διάφορες συχνότητας κολίτιδας. (Ιάπωνες>Τούρκοι)

 Συζήτηση

Τα μη φυσιολογικά αλληλόμορφα τα οποία βρέθηκαν από την παραπάνω έρευνα

και συσχετίστηκαν με την ασθένεια Μπεχτσέτ μπορούν να χωριστούν σε δύο
ευρύτερες κατηγορίες :

● Aλληλόμορφα που οδηγούν σε μειωμένη φλεγμονωδη απόκριση σε

μικρόβια
● Αλληλόμορφα που προκαλούν μειωμένη μικροβιακή κάθαρση
 IL23R
Two low-frequency variants with protective effects (higher frequency in control
participants than in case participants):

● p.Gly149Arg (G149R) in the Japanese population

● p.Arg381Gln (R381Q) in the Turkish population.

These variants are also protective for Crohn disease BD and Crohn disease
may share some pathogenic cytokine response pathways.

Αποδήχθηκε ότι:

-G149R NSV was independent of the previously reported disease-associated

common variant rs1495965 in the Japanese samples

-R381Q partially explained the protective effect of the minor allele variant of the
reported rs924080 association in Turkish samples
 TLR4
Αναγνωρίζει το βακτηριακό παράγοντα LPS.

Σε διέγερση απο LPS,τα ουδετερόφιλα και τα μονοκύτταρα παράγουν φλεγμονώδεις

κυτοκίνες (π.χ. ΤΝΡ-α).

Δύο αλληλόμορφα στους Τούρκους: p. Asp299Gly (D299G) και p.Thr399Ile (T399I)

Και τα δύο οδηγούν σε μειωμένη απόκριση στην ενδοτοξίνη:

Προδιάθεση για Crohn

Προστασία για BD
 NOD2
Περιορίζοντας τις αναλύσεις στα βλαπτικά ή τα σπάνια βλαπτικά NSV, ο ρόλος του
NOD2 ήταν ονομαστικά σημαντικός στη μετα-ανάλυση μας και στις τρεις δοκιμασίες
επιβάρυνσης.

Three coding variants, p.Arg702Trp (R702W), p.Gly908Arg (G908R), and

p.Leu1007fsinsC (L1007fs), were present in the Turkish samples, but not in the
Japanese samples.

Συνδεδεμένα με την ασθένεια του Crohn, αλλά προστατευτικά για τη BD, τα

οποία είναι επίσης συμβατά με τρεις προηγούμενες αναφορές στις οποίες αυτά τα
αλληλόμορφα που σχετίζονται με τη νόσο του Crohn αναφέρθηκαν σε χαμηλότερη
συχνότητα σε ασθενείς με BD απ 'ότι σε υγιείς μάρτυρες ασθενείς
 NOD2
Interestingly, the locations of the Japanese and the Turkish NOD2 NSVs differ: the
Japanese variants cluster around the nucleoside triphosphatase NACHT domain,
whereas the Turkish variants cluster at the leucine-rich repeat end of the protein (Fig.
1), perhaps reflecting the differences in the frequencies of colitis in BD observed
in these populations, which is low among Turkish patients but high among
Japanese patients with BD.

Εικόνα
 MEFV
Ο ρόλος του MEFV στην ασθένεια του ανθρώπου δεν είναι πλήρως κατανοητός

Σχετιζόμενες με FMF παραλλαγές MEFV μεταλλάξεις που αυξάνουν τη

λειτουργηκότητα, άρα οδηγούν σε αυξημένη ανταπόκριση στα βακτηριακά
προϊόντα.

Για παράδειγμα, τα ποντίκια που φέρουν τη μετάλλαξη FMF MEFV M694V

ενεργοποιούν την κασπάση 1 πιο αποτελεσματικά από τα ποντίκια άγριου τύπου.
αα Υπερπαραγωγή της ιντερλευκίνης
1β όταν διεγείρεται μόνο με LPS (26).

Η ισχυρή σχέση που βρήκαμε με το MEFV M694V με κίνδυνο BD συνδέει την

έμφυτη ανοσία με την BD.
Γιατί χρησιμοποιήθηκαν τα συγκεκριμένα τεστ;
Identifying disease-associated rare or low-frequency variants is hindered by the low
power of such analyses in conventional single-variant association tests. We
therefore used three different burden tests developed:

· To increase power by combining the rare and low-frequency NSVs of a

gene and evaluating their collective effect.

· Because no single-burden test is recognized as a gold standard method for

testing the association of rare variants. The three different methods use different
information from the data, we sought consistent results across two or more
burden tests, requiring a minimum P < 0.0024 in one test and P < 0.05 in the
second test, to provide robust evidence for association in our study.
Εγκυρότητα/ αξιοπιστία των αποτελεσμάτων
Although our study includes the largest collection of patients with BD yet reported for a genetic
analysis, our ability to identify genes with disease-associated NSVs among the group of genes
tested was limited by the number of samples used for variant discovery (382 Japanese case
participants, 384 Japanese control participants, 384 Turkish case participants, and 384 Turkish
control participants) and by the total number of case and control participants genotyped (2,461
case participants and 2,458 control participants). Thus, some of the other genes we
sequenced may also have disease-influencing variants, but despite applying burden tests, our
study may be underpowered to detect their effects.