Vitamin B12 is not shared by all marine

prototrophic bacteria with their environment

Sabiha Sultana, Stefan Bruns, Heinz Wilkes, Meinhard Simon & Gerrit Wienhausen
The ISME Journal volume17 (2023)

09134008 吳俊璋
指導教授 : 陳宜龍
1
目錄
• 1.Introduction

• 2.destination

• 3.Methods and materials

• 4.Results

• 5.Discussion

• 6.Conclusion
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Introduction

3
 Introduction
• 微生物對 B12 的使用 可作為輔酶參與到 TCA 循環和氨基酸合成

• 合成 B12 需要 30 多個基因 : 為一種需要消耗能量和大量代謝的生物合成過程，因此

只有一小部分原核生物能從頭合成

• Genome streamlining: 細菌為了降低代謝成本，且在環境中可以取得必需性的化合物

的時候而選擇失去一些合成性基因

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 維生素 B12
• 作為生物體合成代謝中一種重要的輔酶

• 參與的生理反應主要有兩類

1. 碳上的氫原子與鄰位碳上一個基團之間的
交換

ex: 甲基丙二醯 CoA 合成琥珀醯 CoA 的過

程

2. 兩個分子之間的甲基轉移

ex: 由同型半胱胺酸合成甲硫胺酸的反應

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 Introduction

• 在海洋生態系中，只有選擇性異養菌和奇骨菌門可以產生，而產生的量只佔了細菌

群落的五分之一

• 大約一半的已知浮游植物合成甲硫胺酸時依賴 B12

• B12 的供需差距可能導致原核生物和真核生物之間複雜的微生物相互作用

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 Introduction
• 一些研究中，發現了個體異養細菌向缺乏 B12 型浮游植物提供 B12 以換取有機碳

• 已經有許多研究關於革蘭氏陰性菌對 B12 的吸收，但對 B12 的輸出機制能然未得到探索

• B12 家族代謝物大於 1350 道爾頓，因此透過細胞膜擴散為不可能

• 因此不知道是否這是一種原養生物和營養缺乏型微生物之間的相互作用，或是其釋放是無
意的

• 而為了了解這一目標，選擇將 B 12 營養缺陷型矽藻 Thalassiosira pestynana 與 33 種 α-

變形菌類 B 12 原養細菌共培養，以測試細菌與其他微生物共享 B 12 的能力。

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Thalassiosira pseudonana
• Thalassiosira 是中心矽藻屬， Thalassiosira

pseudonana 屬於其中一個物種

• 因其基因組只有 34Mb ，被選為第一個進行全

基因組測序的海洋真核浮游植物

• 成為了解矽藻生物學的模式生物

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 研究目標

• 主要了解到原養生物和營養缺陷型生物之間是否有透過 B12 的共享而發生相互作用

• 對原養生物製造 B12 的能力進行鑑定以及了解是否有製造 B12

• 透過上述幾種結果，以便就 B12 驅動的互利相互作用得出結論

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Material and methods

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 T. pseudonana 培養 培養 B12 原養菌

單獨添加 B12 了解 檢測 B12 原養菌

共培養
T. Pseudonana 生長狀況 製造 B12 的能力

查看 T. pseudonana 透過流式細胞計數
在與細菌共培養下 以及透過相對螢光確認矽藻
生長狀況 和細菌的生長情況
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 Material and Methods

• 培養 B 12 原養細菌

• 先培養在 synchronized artificial seawater(syn-ASW)media

• 在接種之前，用不含 B12 syn-ASW 培養基將生長期後期的培養物洗滌 3 次

（ 5974g ， 5 分鐘 )

12
 Material and Methods

• 鑑定 B 12 原養細菌

• 作為代表的細菌基因組序列必須完整且可在 IMG 上獲取

• 在不添加 B12 的基本培養基中能有從頭合成 B12 的能力和生長（由 OD 測定）

• 如果 B12 生物合成途徑的至少 95% 被註釋，則假定其能從頭合成 B12

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 Material and Methods
• 培養 B 12 缺陷型矽藻 Thalassiosira pseudonana

• 先在 F2 培養基中培養

• 然後在轉移 ( 兩次 ) 至不含 B12 的 syn-ASW 培養基（添加硫胺素（維生素 B1 ）、

核黃素（維生素 B2 ）、菸酸（維生素 B3 ）、泛酸（維生素 B5 ）、鹽酸吡哆醇（維

生素 B6 ）和生物素（維生素 B7 ）；各 500 pM ）

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 Material and Methods
• B12 共培養實驗

• 所有矽藻預培養物和原養細菌培養物均在 70 µE m-2 s-1 下照明，並在 20 °C 下以

12:12 hrs 光暗循環 (RUMED) 孵育

• 對於所有含有細菌的共培養處理，初始細菌接種量經計算為 500,000 個細胞 / 1ml

• 矽藻 - 細菌共培養物在三種不同的條件下生長

1. 將細菌分離珠與 T.pseudonana 共培養，無需進一步添加

2. 共培養物補充了有機碳混合物 (120 µM C) ，其中含有葡萄糖、谷氨酸和醋酸鹽

（每種底物在 40 µM C 下）

3. 將 B 12 (1 pM) 添加到細菌 - 矽藻共培養物中，以確保矽藻的生長不被細菌抑制

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 Material and Methods

• 陰性對照組

• 無菌且未添加 B12 的 T.pseudonana

• 陽性對照組

• 無菌但是添加 1pM B12 的 T.pseudonana

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 Material and Methods
• 細胞內 B12 濃度檢測

1. 通過珠磨提取細胞內 B12 分析的細菌細胞沉澱

2. 細胞裂解進行 3 個週期（最大振盪速度），間隔 30 秒，中間休息 2 分鐘

3. 休息期間，將管子儲存在乾冰上

4. 之後將其懸浮液離心（ 14,000× g ， 10 分鐘， 4 °C ）

5. 將上清液轉移至 4 mL 玻璃瓶中並在氮氣下蒸發。使用 0.5 mL 冰冷的 10 mM 甲酸

銨 (pH 7) 重複提取兩次

6. 合併提取物，在液氮中冷凍並凍乾

7. 將乾燥樣品重懸於 200 μL 水中，並通過 0.22 μm 醋酸纖維素離心過濾器（在 2

mL 聚丙烯管中）過濾

8. 將 100 μL 提取物轉移至 HPLC 小瓶中 17

 Material and Methods
• 細胞外 B12 濃度檢測

• 在固相萃取柱（ HLB ， 1 g ， Macherey-Nagel ）上濃縮

• 並用甲醇洗脫

• 將溶劑提取物在氮氣流下乾燥並重新溶解在 200 µl 水中

• 並通過 0.22 μm 醋酸纖維素離心過濾器（在 2 mL 聚丙烯管中）過濾

• 將 100 μL 提取物轉移至 HPLC 小瓶中

• 使用 LC-MS 測量 細胞內外 B 12 濃度
18
 Material and Methods
• 使用 Ultimate 3000 (ThermoFisher Scientific) 在 Kinetex Evo C18 色譜柱
（ 100 × 2.1 mm ，孔徑 2.6 µm ， Phenomenex ， Torrance ， CA ， USA ）上進行
• 10 mM 甲酸銨 (pH 6.0) (A) 和乙腈 ( B) 與以下溶劑梯度一起使用
1. 0-13 分鐘 100%-75% (A)
2. 13-15 分鐘 75%-0% (A)
3. 15-19 分鐘 0% (A)
4. 19-21 分鐘 0%-100% (A)
5. 21-26 分鐘 100% (A)

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 Material and Methods

• 了解 T. pseudonana 對 B12 的需求

• 在 syn-ASW 培養基中培養無菌矽藻，並添加不同的 B 12 濃度（ 5 、 10 、 25 、

50 和 100 pM ）

• 所有培養物均在 70 µE m-2 s-1 下照明，並在 20 °C 下以 12:12 hrs 光暗循環

孵育。每兩到三天通過相對熒光和細胞數量的測定來檢測生長情況

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 Material and Methods
• 細菌和矽藻計數
• 使用玻璃珠 (2.3 mm) 和超聲波處理（ 35 °C ， 70% ， 4 × 5 分鐘， Sonorex
digital 10P ， Bandelin ，柏林，德國）將細菌細胞與矽藻細胞分離

• 每個超聲波間隔後進行短的渦旋步驟（ 2 × 2 秒， Vortex Genie2 ， Scientific

Industries Inc. ，紐約，美國）

• 用 SybrGreen I 對細菌細胞進行染色，樣品用濃度為 1% 的 GDA 固定，在 4

°C 下孵育 30 分鐘，並保存在 -20 °C 下直至通過流式細胞儀進行計數（ BD
Accuri C6 ， BD biosciences ， Franklin Lakes NJ ， USA ）
21
 Material and Methods
• 細菌和矽藻生長狀況

• 在整個實驗過程中，通過相對熒光（ TD 700 熒光計， Turner Designs ，加利福

尼亞州，美國）測定了細菌和 T.pseudonana 的生長情況。

22
Results

23
 Results
• T.pseudonana 在不同 B 12 濃度下的生長 ( 螢光 )

24
 Results
• T.pseudonana 在不同 B 12 濃度下的生長 ( 細胞計數 )

25
26
T.pseudonana 在
與 B12 原養菌共培
養中的生長 ( 提供
菌)
18 種

27
T.pseudonana 在
與 B12 原養菌共培
養中的生長 ( 保留
菌)
9種

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 • 細菌與矽藻共培養的生長特性

Results • 在大多數不添加底物或 B 12 提供菌 - 矽藻共

培養物中， T.pseudonana 獲得了與額外供應
B 12 相同的生長產量

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 • 細菌與矽藻共培養的生長特性

Results • 在 B 12 保留菌 - 矽藻共培養物中檢測到的不添

加任何底物和添加底物的 T.pseudonana 的相
對熒光與 T.pseudonana 的陰性對照值相當

30
 Results
• 細胞內和細胞外 B 12 濃度
• 在 B12 提供菌株中， M. algicola 和 P. inhibens 中均檢測細胞外 B12

31
 Results
• 細胞內和細胞外 B 12 濃度
• 在 B12 保留菌株中，我們無法在八種細菌培養物中的四種中檢測到細胞內 B12

32
Discussion

33
 Discussion
• 不同細菌的 B 12 生物合成潛力

• 儘管原核生物和真核生物都需要合成 B12 這種輔因子，但從頭合成僅限於一小部分

細菌和古細菌，因此表明合成 B12 的能力與其自然界的需求不成比例

• 這種現象可以在各種環境中觀察到，例如在土壤微生物組中，其中 B 12 生產者的比

例不到十分之一

• 人類皮膚微生物組也顯示出類似的結果，其中只有 1% 的物種會從頭產生 B12 ，

34
而 39% 的物種會使用 B12 進行新陳代謝
 Discussion
• 不同細菌合成 B12 的能力
• 在檢測的各種異養細菌之間的細胞內 B 12 濃度差異很大，每個細胞檢測到的 B 12

分子範圍為 664 至 26,619 個

• 而在其他研究中，其他原核生物檢測到的細胞內 B12 值相差三個數量級，並且顯示

的值與我們檢測到的值相似

• 表示各個細胞對 B12 的不同需求或 B12 合成的不同調節機制對細胞內 B 12 濃度起到了

決定性作用

• 得出結論，不僅 B12 微生物群落內的生物合成潛力是決定性的，但實際存在的原核

生物對於 B12 的可用性至關重要 35

 Discussion
• 細菌對 T.pseudonana 生長
的影響
• 觀察到玫瑰桿菌屬的代表蘇菲托
桿菌（ Sulfitobacter
litoralis ）對矽藻表現出抑制
行為

36
 Discussion
• 細菌對 T.pseudonana 生長
的影響
• Celeribacter baekdonensis
DSM 27375 顯著刺激了
T.pseudonana 的生長，原因為
C. baekdonensis 合成和排泄吲
哚乙酸（ IAA ），這是一種
矽藻生長促進激素

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 Discussion
• 細菌對 T.pseudonana 生長的影響
• 在我們的研究中，一個似乎被忽視的發現是，預期的細菌細胞死亡並不一定會導致 B 12

的釋放

• 即使在共培養長達六週後，儘管存在細菌 B 12 原養菌，我們仍無法觀察到 T.pseudonana

的顯著生長

• 這一事實凸顯了自然界中細胞裂解機制的重要性，例如由病毒感染或餵養不當引起的細
胞裂解機制

• 此外，已知 T.pseudonana 在 B 12 缺陷條件下分泌 B12 結合蛋白，其親和常數為 2 × 1011 M-

1
。當這種蛋白質通過細胞裂解機制釋放時，可能會幫助它們從周圍環境中獲取 B 12 38
 Discussion
• 並非所有原養型細菌都共享輔助因子 B 12

• 在我們的研究中，我們假設並非所有 B 12 原養菌都與其他微生物共享 B 12 ，並證明我們

在不同微生物之間進行了單獨的共培養實驗

• 發現它們通過提供必需的輔因子 B12 提供者而使 T. pseudonana 生長，稱為 B12 提供菌。另

一方面，我們還鑑定了第二組不支持 T. pseudonana 生長的 B12 原養細菌，即 B12 保留菌

• 了解到儘管它們都擁有 B12 生物合成所必需的基因，但有些細菌共享輔因子，而另一些細

菌儘管在共培養中強制相互作用，卻沒有共享

• 我們討論了我們認為合理的三種情況，所有三種情況都有發生在我們已識別的 B 12 - 保留
菌
39
 Discussion

• I. B12 生物合成途徑的轉錄調控決定了細胞中是否合成 B12 以及合成量

• 在細菌分離株丙酸桿菌菌株 UF1 中，核糖開關 cbiMCbl 被鑑定可調節 cobA 操縱子的基因

表達，從而控制 B12 生物合成

• 已知，充足的 B12 可用性可以抑制細菌中 B12 生物合成基因的表達

• 檢測到的細胞內 B12 濃度差異較大，可能是由於不同細菌的基因調控差異造成的，並且也可

能對與 T.pseudonana 共培養中 B12 的釋放有影響

40
 Discussion
• II. 鈷胺素屬於一種 B 12 代謝物，稱為鈷酰胺。每種鈷酰胺的不同之處在於所連接

的下部配體

• 例如，常見的鈷胺鈷胺素對大多數微生物具有生物利用度，其下配體為 5,6- 二甲

基苯並咪唑 (DMB)

• 目前已經發現了十幾種鈷酰胺類和鈷酰胺類似物，然而對鈷酰胺的合成和實際多樣

性的研究，特別是在海洋細菌和古細菌中，仍處於起步階段

• 在我們的研究中，我們無法在八種細菌 B 12 保留菌株中的四種中檢測到細胞內

B 12 ，儘管採樣時的細胞計數應該足以檢測到 41
 Discussion
• 我們的 LC-MS 分析僅針對鈷胺素 (B 12 ）及其不同的上部配體（腺苷 - 、氰

基 - 、甲基 - 和羥鈷胺）。因此，我們不能排除這裡研究的細菌合成不同的鈷酰胺

的可能性

• 這些鈷酰胺可能對 T.pseudonana 沒有生物利用度或生物利用度較低，並且不包括

在我們的分析測量方法中

• Ex: 這四種 B 12 - 保留菌株之一，硫酸桿菌屬 (Sulfitobacter sp.) 。 DFL-

23 ，不具有 DMB 合成基因 bluB ，並且在該菌株中未檢測到細胞內 B 12

42
 Discussion

• III. 我們鑑定為 B 12 保留菌的細菌可能根本沒有主動將合成的 B12 釋放到其環境中。

• 據我們所知，其排泄機制仍然很大程度上未知。 B12 的大小超過 1,350 道爾頓，不

允許通過細胞膜充分擴散

• 研究結果表明，並非所有細菌都與其環境共享關鍵輔助因子

• 因此，對於群落內的一些 B12 原養型細菌來說，輔助因子很可能僅在細胞裂解時釋放

• 而這影響了我們目前對海洋 B 12 循環的理解，並且可能對其他生態系統也有影響

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 Discussion
• 海洋生態系統中的 B 12 生產及其生態影響
• 研究的結果顯示出輔助因子的生物合成潛力和與環境共享這些因子的能力之間存在
顯著差異

• 生態系統內維生素 B12 的來源數量是取決於生態系統內原養原核生物合成並主動釋放

的輔助因子的多寡

• 我們的結果發現即可能存在主動釋放的細菌機制，或者細胞裂解時釋放。用於在海
洋以及可能還有其他生態系統中釋放維生素

• 大多數 B12 提供菌株是從真核微生物中分離出來或在與真核微生物相關的過程中發

現的，而大多數 B12 保留菌株是在海洋中自由生活的

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Conclusion

45
 Conclusion

• B12 原養型細菌並不一定表明與其他營養缺陷型微生物存在互利相

互作用。然而， B12 提供者的細菌群似乎尤其有利於與其他微生

物緊密接近地生活，這就是為什麼 B12 與有機化合物的交換可以

將其本身建立為個體微生物之間獨特的共生相互作用。

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Future Work

47
 Future Work

• 在這項研究中，我們僅研究了 α- 變形菌綱的細菌，因為已知
其中很大一部分是 B12 原養菌，並且在海洋生態系統中含量豐富。
對於未來的研究，看看是否可以在其他類別的細菌中觀察到類似
的 B12 供應模式

• 以及能發現關於 B12 的提供機制

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The end

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