ENZIMI

I Bazini koncept i kataliza

Prof. dr Lejla Begi

1

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Neromantian je, ali produktivan nain da se ivot, odn. metabolizam posmatra kao skup koordiniranih hemijskih reakcija.

ta omoguava odvijanje hemijskih reakcija?

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Da li e se neka hemijska reakcija odvijati u odreenim uslovima zavisi od zakona termodinamike.

Favorizirane su reakcije u kojima dolazi do poveanja nereda. Generalno, ako se u reakciji oslobaa energija, reakcija je favorizirana.

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Za ivot su neophodne mnoge nefavorizirane rekacije. Kako je mogue njihovo odvijanje?

favorable reactions

unfavorable reactions

Kuplovanje favoriziranih sa nefavoriziranim reakcijama.

The Nature of Life Kuplovanje favoriziranih i nefavoriziranih reakcija

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Enzimi su katalizatori u biolokim sistemima.

Uestvuju u katalizi hemijskih reakcija. Uestvuju u transformaciji jednog oblika energije u drugi.

ENZIMI
Aktivnosti enzima su esto regulirane za razliku od drugih katalizatora

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI- Istorijat

1837. Berzelius uveo pojam kataliza - Pasteur izgraeni i neizgraeni fermenti 1878. Khne-naziv enzim 1897. Bchner-alkoholno vrenje in vitro 1926. Sumner-izolacija ureaze u kristalnom stanju

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Gotovo svi enzimi su proteini.

Proteini nemaju apsolutni monopol u katalizi. RNA molekule su najstariji biokatalizatori.

10

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Enzimi su snani i visoko specifini katalizatori. Enzimi ubrzavaju reakcije milion i vie puta.

11

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

12

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Reakcija koju katalazira karboanhidraza-hidratacija karbon dioksida ubrzava se 107 puta.

Jedna enzimska molekula moe hidratisati 106 molekula CO2 u sekundi.

13

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Enzimi su visoko specifini u odnosu na reakciju koju kataliziraju. Enzimi su visoko specifini u odnosu na supstrat.

14

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Proteolitiki enzimi in vivo kataliziraju proteolizu

15

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Veina proteolitikih enzima in vitro katalizira hidrolizu esterske veze.

16

ENZIMI
(A)Tripsin

Proteolitiki enzimi se znaajno razlikuju na osnovu specifinosti prema supstratu.

(B)Trombin

17

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Specifinost enzima je rezultat precizne interakcije enzima i supstrata. Preciznost je rezultat trodimenzionalne strukture enzimskog proteina.

18

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Veliki broj enzima za svoju aktivnost treba kofaktore. Apoenzim + Kofaktor = Holoenzim

19

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI
Kofaktori se dijele u dvije grupe:

1.Metali

2. koenzimi- male organske molekule koje su esto derivati vitamina

Koenzimi mogu biti labavije ili vre vezani za enzim.

vrsto vezani koenzimi su prostetske grupe.

20

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI
Metali uestvuju u enzimskim reakcijama kao: 1. Lewisove kiseline-prelazni metali-Zn, Fe, Mn, Cu 2. Helatne formacije-hem-organometalni koordinativni kompleks Metal moe biti: 1. 2. 3. 4. Dio aktivnog centra (karboksipeptidaza-Zn protein) Veza izmeu enzima i supstrata (kreatin kinaza) Uesnik u hemijskoj reakciji (citohromi) Stabilizacijski faktor enzima (Ca2+ za amilazu)

21

ENZIMI

22

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

U mnogim biohemijskim reakcijama energija reaktanata se transformira u druge oblike sa visokim stupnjem efikasnosti. U fotosintezi svjetlosna energija se transformira u energiju hemijskih veza.
23

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Drugi primjeri: Miozin transformira energiju ATP u mehaniku energiju miinih kontrakcija. Membranske pumpe prevode energiju ATP za transport iona i molekula kroz membranu.

24

ENZIMI

Prevoenje hemijske energije u energiju transporta iona kroz membranu.

25

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Slobodna energija (G) je korisna termodinamika funkcija za razumijevanje enzima

Dvije vane termodinamike osobine neophodne za razmijevanje enzimskih reakcija su: 1. razlika slobodne energije izmeu proizvoda i rektanata(G) 2. energija neophodna za inicijaciju konverzije reaktanata u produkte

26

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Promjena slobodne energije ( G) ukazuje da li se reakcija odvija spontano. Reakcija se odvija spontano ako je G<0. Sistem je u ravnotenom stanju kada je G=0. Reakcija se ne odvija spontano ako je G>0. Potreban je input slobodne energije da bi se pokrenula reakcija. Ove se reakcije nazivaju endergonim. G ne ovisi o putu ili molekularnom mehanizmu transformacije. G ne daje informacije o brzini reakcije.
27

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Promjena slobodne energije reakcije povezana je sa konstantom ravnotee

G G 0 RT ln

C D A B

gdje je G0 promjena standardne slobodne energije, odnosno slobodne energije pri standardnim uslovima koncentracije reaktanata A,B,C i D od 1 mol/L za gasove obino se uzima standardno stanje 1 atmosfera. G reakcije zavisi od prirode reaktanata (G0) i njihove koncentracije.
28

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Da bi se pojednostavila kalkulacija slobodne energije konvencijom je prihvaen pojam standardnog stanja pri pH 7.

Promjena standardne slobodne energija pri pH 7 (oznaava se sa G0) je korisna termodinamika funkcija za razumijevanje enzima.

29

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI
Odnos izmeu konstante ravnotee hemijske reakcije i standardne slobodne energije povezan je jednostavnim izrazom:
G 0 '

K 'eq 10

5 , 69

G0 je u gornjoj jednaini izraena u kilojoule-ima po molu.

30

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Promjena konstante ravnotee za 10 puta dovodi do promjene standardne slobodne energije za priblino 5,69 kJ/mol, odnosno 1,36 kcal/mol.

31

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

Kriterij za spontanost hemijske reakcije je G, a ne G0. Reakcije koje nisu spontane na bazi G0, mogu postati spontane podeavanjem koncentracija reaktanata i produkata. Ovaj princip je baza kuplovanja reakcija u metabolikim putevima.

32

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Enzimi mijenjaju brzinu hemijske reakcije i ne mijenjaju ravnoteu

Enzimi ubrzavaju postizanje hemijske ravnotee, a ne pomjeraju njenu poziciju. Mijenjaju put postizanja finalnog stanja. Ista ravnotena taka se postie mnogo bre u prisustvu enzima. Ravnoteni poloaj samo je funkcija razlike slobodne energije izmeu reaktanata i produkata reakcije.
33

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Enzimi ubrzavaju reakcije tako to olakavaju formiranje prelaznog stanja.

Prelazno stanje je kratkotrajna molekularna struktura koja vie nije supstrat, ali jo nije ni proizvod reakcije.

Prelazno stanje je najnestabilnija struktura tokom hemijske

reakcije zato jer sadri najvie slobodne energije.

34

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI
Razlika slobodne energije izmeu prelaznog stanja i supstrata naziva se Gibbsova slobodna energija aktivacije ili samo energija aktivacije i oznaava se sa G. Zadatak enzima je da sniavaju energiju aktivacije. Enzimi ubrzavaju reakciju tako to sniavaju energiju aktivacije. Sutina katalize je specifina stabilizacija prelaznog stanja.

35

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI

36

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Enzimi sniavaju energiju aktivacije.

37

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Stvaranje kompleksa enzim-supstrat prvi je korak u enzimskoj katalizi

38

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Stvaranje kompleksa enzim-supstrat prvi je korak u enzimskoj katalizi

Najvei dio katalitike moi enzima proizilazi iz njegove osobine da povezuju supstrate u pogodnu orijentaciju za poetak formiranja prelaznog stanja. Enzimi povezuju supstrate u tzv. enzim-supstrat komplekse (ES).

Supstrat se vee za specifino mjesto na enzimu koje se zove aktivno mjesto.

39

Prof. dr Lejla Begi

ENZIMI
Dokazi za postojanje kompleksa enzim-supstrat su: 1. 2. 3. 4. saturaciona kinetika rentgenostrukturna analiza spektroskopske karakteristike elektronska mikroskopija (DNA polimeraza I sa DNA)

40

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Pri konstantnoj koncentraciji enzima poveava se brzina enzimske reakcije sa poveanjem koncentracije supstrata sve dok se ne postigne maksimalna brzina reakcije.
Pri dovoljno velikoj koncentraciji supstrata sva katalitika mjesta su popunjena tako da se brzina reakcije vie ne poveava.

41

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Kristalografija x-zracima daje slike visoke rezolucije supstrata ili analoga supstrata vezanih za aktivno mjesto enzima. Na slici je prikazana struktura kompleksa enzima citohroma P450 i njegovog supstrata-kamfora.
42

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Spektroskopske karakteristike mnogobrojnih enzima i supstrata mijenjaju se formiranjem ES kompleksa. Na slici je prikazana promjena intenziteta fluorescencije piridoksal fosfata na aktivnom mjestu triptofan sintetaze dodatkom supstrata serina i indola.

43

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

Podruje na enzimu gdje se vee supstrat i kofaktor naziva se aktivni centar enzima.
Aktivni centar sadri ostatke koji su direktno ukljueni u formiranje i cijepanje hemijskih veza.

Ovi ostaci se zovu katalitike grupe.

Interakcija enzima i supstrata na aktivnom centru inicira formiranje prelaznog stanja.

44

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

1. Aktivno mjesto je trodimenzionalna tvorevina, procijep, udubljenje ili dep, koje formiraju grupe koje su meusobno udaljene u primarnoj sekvenci. Ove grupe se mogu vre vezati nego susjedni ostaci u sekvenci.

45

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

Komponente aktivnog centra lizozima obiljeene razliitim bojama.

46

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

Komponente aktivnog centra lizozima obiljeene razliitim bojama.

47

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

2. Aktivni centar zauzima relativno mali dio od ukupnog volumena enzima.

U mnogim proteinima preostale aminokiseline ine regulatorna mjesta, mjesta interakcije sa drugim proteinima ili kanale za pristup supstrata aktivnom mjestu.
48

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

3. Aktivna mjesta su jedinstvene mikrosredine. U procjepima aktivnih mjesta obino nema vode kada je za njih vezan supstrat. Nepolarna mikrookolina pojaava vezanje supstrata i katalizu.

49

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

4. Supstrati se veu za enzime mnogobrojnim slabim vezama U slabe reverzibilne interakcije spadaju: elektrostatske interakcije sa ili bez metalnih kationa hidrogenske veze hidrofobne interakcije van der Waalsove sile rijetko kovalentne veze
50

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Hidrogenske veze izmeu enzima i supstrata. Enzim ribonukleaza formira hidrogenske veze sa uridinskom komponentom supstrata.
51

ENZIMI- aktivno mjesto

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

5. Specifinost vezanja zavisi od precizno definiranog rasporeda atoma u aktivnom centru.

52

ENZIMI- aktivno mjesto

Prof. dr Lejla Begi

Aktivna mjesta enzima imaju zajednike karakteristike

Aminokiseline koje ee ulaze u strukturu aktivnog centra su: Histidin Karboksilat ioni glutamata ili aspartata Arginin Cistein

53

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Klju-brava model koji je postulirao 1890. E. Fischer.

54

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Model izazvanog prilagoavanja za vezanje enzima i supstrata. Postulirao ga je D.E.Koshland 1958.god.

55

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Izazvano prilagoavanje sa naprezanjem supstrata

Sterike i elektronske deformacije molekule supstratakonformacijski stres

56

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Energija vezanja izmeu enzima i supstrata veoma je vana za katalizu

Formiranjem velikog broja slabih interakcija izmeu enzima i supstrata dolazi do oslobaanja slobodne energije. Ova osloboena energija naziva se energija vezanja. Samo pravi supstrat moe participirati u veini ili u svim interakcijama sa enzimom i tako maksimizirati energiju vezanja. Puni komplement interakcija formira se samo ako je supstrat u prelaznom stanju.
57

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Energija vezanja izmeu enzima i supstrata veoma je vana za katalizu

Energiju koja se oslobodi prilikom interakcije enzima i supstrata moemo smatrati snienjem energije aktivacije. Paradoksalno najstabilnija interakcija (maksimum energije vezanja) odvija se izmeu enzima i prelaznog stanja-najmanje stabilnog intermedijera u reakciji. Prelazno stanje traje veoma kratko i kolabira ili u supstrat ili u proizvod reakcije to je odreeno samo energetskom razlikom izmeu supstrata i produkata, tj. sa vrijednou G reakcije.
58

Usklaivanje enzima i supstrata je precizno i kritino

Enzim heksokinaza (plavo), vee supstrat, glukozu (uto).

59

ENZIMI- alosteriko mjesto

Prof. dr Lejla Begi

Mjesto na molekuli proteina na koje se veu male molekule i uzrokuju promjenu aktivnog mjesta ili mjesta vezanja supstrata. Na taj nain aktivno mjesto moe poveati ili smanjiti afinitet prema supstratu.

60

Deficijencija enzima i zdravlje

Veina genetskih poremeaja je povezana sa funkcijom enzima. Na slici je prikazano troje djece sa fenilketonurijom.
61

Metaboliki putevi

Za sintezu biolokih molekula neophodni su metaboliki putevi ije reakcije kataliziraju enzimi.
62

ENZIMI

Prof. dr Lejla Begi

Enzimi se dijele na osnovu vrste reakcije koju kataliziraju.

1964. IUB Enzimska Komisija objavila klasifikaciju enzima sa 4 broja.

Komitet za nomenklaturu pri Internacionalnoj uniji za biohemiju i molekularnu biologiju (NC-IUBMB=International Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) je izvrio klasifikaciju enzima.

Komisija za enzime (Enzyme commission) je, prema tipu hemijske reakcije koju kataliziraju, enzime klasificirala u est glavnih grupa (klasa).
Svaki enzim je dobio svoje oficijelno (slubeno) ime, a esto i alternativno ime.
63

ENZIMI
Klase enzima:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Oksidoreduktaze Transferaze Hidrolaze Liaze Izomeraze Ligaze

64

ENZIMI
Svaki enzim ima svoj identifikacijski broj (kod) koji se naziva EC broj EC broj (Enzyme commission) se sastoji od etiri cifre Prva cifra predstavlja broj klase Druga cifra oznaava broj podklase Trea cifra predstavlja broj podpodklase etvrta cifra predstavlja redni broj enzima u podpodklasi

65

ENZIMI
Enzim: EC 1.1.1.1 Oficijelno ime: alkohol dehidrogenaza Alternativno ime: Aldehid reduktaza Reakcija koju katalizira: Alkohol + NAD(+) <=> aldehid ili keton + NADH Kofaktor(i):Cink ili eljezo Komentar: Djeluje na primarne ili sekundarne alkohole ili hemiacetale, te na cikline sekundarne alkohole u ivotinja
66

ENZIMI- klasifikacija
1. Oksidoreduktaze
Uestvuju u redoks reakcijama. Kataliziraju prijenos atoma hidrogena, oksigena ili elektrona izmeu molekula. Ova ekstenzivna klasa obuhvata: Dehidrogenaze koje kataliziraju prijenos atoma vodika Oksidaze koje kataliziraju transfer elektrona na molekularni oksigen Oksigenaze koje sudjeluju u prijenosu atoma kisika sa molekularnog kisika Peroksidaze koje kataliziraju elektron transfer na perokside

67

ENZIMI- klasifikacija

-D-glukoza + oksigen = D-glukono-1,5-lakton + hidrogen peroksid Reakcija glukoza oksidaze (EC 1.1.3.4)
68

ENZIMI- klasifikacija
2. Transferaze
Kataliziraju transfer atoma ili grupe atoma (npr. acil, alkil, glukozil) izmeu dvije molekule.

L-aspartat + 2-oksoglutarat = oksaloacetat + L-glutamat

Reakcija ASAT
69

ENZIMI- klasifikacija
3. Hidrolaze
Sudjeluju u hidrolitikim reakcijama tj. prenoenju funkcionalnih grupa na vodu. Obuhvataju esteraze, glikozidaze, lipaze i proteaze.

-kazein + voda = para- -kazein + kazeino makropeptid himozin (EC 3.4.23.4)

70

ENZIMI- klasifikacija
4. Liaze
Uestvuju u reakcijama eliminacije u kojima se grupe atoma uklanjaju sa supstrata. Reakcije adicije grupa na dvostruku vezu ili stvaranje dvostruke veze uklanjanjem grupa. Aldolaze, dekarboksilaze, dehidrataze i neke pektinaze pripadaju liazama.

histidin amonijak-liaza (EC 4.3.1.3) L-histidin urokanat + amonijak

71

ENZIMI- klasifikacija
5. Izomeraze
Kataliziraju transfer grupa unutar molekula pri emu nastaju izomeri. Obuhvataju epimeraze, racemaze i intramolekularne transferaze.

Glukoza izomeraza (EC 5.3.1.5) -D-glukopiranoza = -D-fruktofuranoza

72

ENZIMI- klasifikacija
6. Ligaze (sintetaze)
Kataliziraju stvaranje kovalentnih veza spajanjem dvije molekule.

Kataliziraju kondenzacione reakcije stvaranja C-C, C-S, C-O i C-N veza uz hidrolizu nukleozid trifosfata (ATP).

glutation sintaza (EC 6.3.2.3) -L-glutamil-L-cistein + ATP + glicine = glutation + ADP + fosfat
73

ENZIMI- klasifikacija
primjer Metionin Sintaza EC 2.1.1.13

74

Common name: methionine synthase Reaction: 5-methyltetrahydrofolate + Lhomocysteine = tetrahydrofolate + L-methionine For diagram click here. Other name(s): 5-methyltetrahydrofolatehomocysteine S-methyltransferase; 5-methyltetrahydrofolatehomocysteine transmethylase; Nmethyltetrahydrofolate:L-homocysteine methyltransferase; N5methyltetrahydrofolate methyltransferase; N5-methyltetrahydrofolate homocysteine cobalamin methyltransferase; N5-methyltetrahydrofolic homocysteine vitamin B12 transmethylase; B12 N5-methyltetrahydrofolate homocysteine methyltransferase; methyltetrahydrofolatehomocysteine vitamin B12 methyltransferase; tetrahydrofolate methyltransferase; tetrahydropteroylglutamate methyltransferase; tetrahydropteroylglutamic methyltransferase; vitamin B12 methyltransferase; cobalamin-dependent methionine synthase; methionine synthase (cobalamin-dependent); MetH Systematic name: 5-methyltetrahydrofolate:L-homocysteine Smethyltransferase Comments: Contains zinc and cobamide. The enzyme becomes inactivated occasionally during its cycle by oxidation of Co(I) to Co(II). Reactivation by reductive methylation is catalysed by the enzyme itself, with S-adenosyl-Lmethionine as the methyl donor and a reducing system. For the mammalian enzyme, the reducing system involves NADPH and EC 1.16.1.8, [methionine synthase] reductase. In bacteria, the reducing agent is flavodoxin, and no further catalyst is needed (the flavodoxin is kept in the reduced state by NADPH and EC 1.18.1.2, ferredoxinNADP+ reductase). Acts on the monoglutamate as well as the triglutamate folate, in contrast with EC 2.1.1.14, 5methyltetrahydropteroyltriglutamatehomocysteine S-methyltransferase, which acts only on the triglutamate.
75